种质创新

1、菜薹种质资源创新有哪些方面？

一、传统方法在菜薹种质创新中的应用

现有菜薹种质资源主要来源于常规途径，常规技术中应用最多的方法是系统选育法，即根据育种目标对原始材料中的不同株系进行多次选择、比较鉴定，筛选出优良的种质。利用这种方法，广东省广州市蔬菜科学研究所选育出四九心-19号，四九心-20号，其中四九心-19号产量比四九心增产1950～3900kg/ km2，叶色较深绿，主薹高度增加6～8cm，除耐热、耐湿外，还较耐霜霉病和菌核病，是目前菜薹常规品种中种植面积最大的早熟品种之一。十月红菜薹则是由胭脂红中发现的优良单株经过系谱选育而得，曾是湖北省的主栽品种，且被推广到长江流域各省。

华南农业大学植保系筛选出抗病毒病品种60天特青，然后对60天特青经单株选择的20多个不同株系进行田间比较，选出代号为8722的中花菜心品种，后来又对8722菜心进行优质、丰产、耐病毒病的系统选育，筛选出8722选菜心新品种。

油绿50天菜心则是利用四九菜心与50天菜心杂交选育的151菜心为母本，以60天菜心为父本，杂交后经过连续8代自交选育而成（张华等，2005）。

张华等（2005）于1999年利用迟心2号与60天油青菜心杂交，经连续6代自交系选出叶薹油绿、商品性较理想的油绿701品种。

雄性不育是高等植物中普遍存在的一种现象，十字花科芸薹属作物杂种优势明显，采用雄性不育系制种是此属作物利用杂种优势的主要途径之一。回交转育是获得优良雄性不育系的最常用的方法。李大忠（2002）从福州市地方菜薹品种七叶心自交后代中发现不育株。经过一代测交，三代回交后，不育株率稳定在50%左右，获得雄性不育两用系66A。用66A与小白菜杂交，杂种一代的一般性状偏向小白菜，表现出较强的生长优势，尤其是可食用部分较父母本增长了1～2倍；品质却偏向菜薹，略带甜味，柔软可口。赵利民等（2005）以大白菜CM S341127为不育胞质供体，以柳州早菜薹为受体，通过杂交、连续回交方法育成菜薹胞质雄性不育系TC12321。TC12321植株生长发育正常，不育性稳定，雌蕊功能正常，蜜腺发育健全，自然授粉结实良好，经济性状优良，配合力高，综合抗病性强。许明等（2003）利用大白菜核不育系9810721 作为不育源，以紫菜薹ZB3 为目标亲本，经过杂交、自交、兄妹交等转育手段，将雄性不育基因转育到紫菜薹中，获得紫菜薹“甲型”两用系、临时保持系和雄性不育系。而且笔者采用同样的方法，将核不育基因向菜薹品种转育，得到了含有早-49遗传基因的新甲型两用系、临时保持系和雄性不育系（许明等，2006）。王玉刚等（2005）亦通过杂交、自交等方法，将白菜雄性核不育性向菜薹可育品系03S001（翡翠油青菜心）中转育，获得了新的菜薹100 %核不育系及其相应的甲型两用系和临时保持系。

二、远缘杂交在菜薹种质创新中的应用

菜薹和油菜的AA组染色体相同，且其种间杂交有低度育性，为将油菜雄性不育基因转育到菜薹上提供了条件。刘胜洪等（2006）的试验表明：杂交后代的花药不育率为F1代＜BC1代＜BC3代，在BC3代群体植株中，不育率为94.60%，接近BC2代植株不育率水平，说明在不断的回交过程中，植株的不育率越来越高并相对稳定。

晏儒来、向长萍等（2000）于1988年开始向紫菜薹转育波里马油菜雄性不育系，以甘蓝型油菜和紫菜薹的杂种作母本，最初用大股子作转育亲本，经过4年6代的转育选择，于1992年秋从240个测交种中获得不育率达100%且性状相对稳定的材料3 份，即0-1、0-2-2、28-9 及其相应的保持系5 -1-4、5-1-3 和29-4-2。为了改良上述不育系的综合性状，1995年以抗病、早熟、耐热和菜薹无苦味为主要改良目标性状，选用了OF 系统（十月红2号×四九菜心）的一些早熟株系和十月红2号的一些株系为转育亲本。选用9405的F2 中19个不育株作母本杂交，在后代中坚持选不育率高的测交种，再从中选不育性彻底，生长势较强，早、中熟，抗病性强，且无苦味的不育株。经过3年6 代的选择，于1997年秋育成不育率达100%且综合性状较好的不育系9617、9630、9631 及其相应的保持系。其中9617 自播种至开始采收为40～45d，9630 为50d，9631 为55d左右。

刘自珠（1996）利用甘蓝型油菜雄性不育株为不育源、菜薹为转育父本，通过种间杂交、连续回交，选育出菜薹胞质雄性不育系002-8-20A及相应的保持系049-20B。该不育系结实正常，不育株率和不育度达到93%以上，已用于杂种一代组合的配制。

张成合等（2003）将菜薹同源三倍体与二倍体相互杂交，3x×2x的结籽率为34.78%，2x×3x的结籽率为26.17%。经染色体检查，杂交子代植株绝大多数为非整倍体，其中三体植株占33.3%（3x×2x）和40.70%（2x×3x）。经细胞学鉴定和核型分析，从三体植株中初步鉴定出三体3、三体7、三体8和三体9 等4 种初级三体。这些都是难得的遗传材料。

黄邦全等（1999）通过种间杂交将Ogura 萝卜雄性不育细胞质导入了紫菜薹，通过连续回交获得了叶色正常、蜜腺正常的紫菜薹Ogura细胞质雄性不育系。黄邦全（2002）以Ogura细胞质雄性不育紫菜薹（AA，2n=20）为母本，以不同萝卜品种（RR，2n=18）为父本进行杂交，获得了大量的属间杂种。杂种F1幼苗在低温下子叶及真叶均不缺绿，以红萝卜为父本获得的杂种F1植株叶柄、叶脉呈紫红色；以白萝卜为父本获得的杂种F1植株叶柄和叶脉不呈紫红色。所有的杂种F1植株都开白花，蜜腺正常。雄配子高度不育，但是雌配子具有部分育性。杂种F1花粉母细胞的染色体数目为预期的2n=19，染色体平均配对构型为15.53Ⅰ＋1.34Ⅱ＋0.25Ⅲ＋0.01Ⅳ，多数染色体以单价体的形式存在，但也有一些二价体、三价体甚至四价体，最多达到6Ⅰ＋3Ⅱ＋1Ⅳ，参加配对的染色体数达13条，表明A染色体组和R染色体组具有一定的同源性，萝卜染色体上的有利基因可以通过部分同源重组或者代换进入到紫菜薹中。同时，在F1中发现了2株染色体自然加倍的双二倍体。双二倍体与未加倍的杂种F1都表现为父本萝卜的白花性状，蜜腺正常，低温下子叶不黄化。虽然双二倍体在减数分裂过程中能形成具有19条染色体的配子，双二倍体的花药比未加倍的杂种F1发育要好得多，但是双二倍体的育性还是低于未加倍的杂种F1。尽管未加倍的杂种F1在减数分裂时多数染色体以单价体的形式存在，同时也有二价体、三价体甚至四价体的形成，并且存在落后染色体和染色体桥。

黄邦全（2002）以OguraCMS紫菜薹×萝卜杂种F1（AR，2n=19）为母本，以甘蓝型油菜（AACC，2n=38）为父本进行杂交，获得了8 株杂种植株。其中1株（PRN-1）的花色为嵌合体，该植株上的花多为黄色，但是也有乳白色花，另外还有1朵花甚至1个花瓣上同时具有黄色和白色区域，其余3株（PRN-2、PRN-3、PRN-4）都开白花。PRN-4的花药开花前退化，其余3株都可以看到3～6枚花药，能够产生部分花粉，但是PRN-2的花粉不能被I2-KI溶液染色。PRN-2具有4个蜜腺，PRN-1和PRN-3具有2个蜜腺，PRN-4无可见蜜腺。在低温下，PRN-2叶色正常，其余3株幼叶表现不同程度缺绿。PRN-1的染色体数目为2n=38，PNR-2的染色体数目为2n=35，PRN-3的染色体数目为33，PRN-4的染色体数目未能确定。它们的染色体平均配对构型各不相同。与甘蓝型油菜回交后，PRN-1、PRN-2、PRN-3 植株各自产生了一定数量的种子，而PRN-4则未产生种子。

梁红等（1994）用杂种胚离体培养的方法获得了菜薹与甘蓝的正反交F1代。杂种一代的一般性状介于两亲本之间，偏向父本，并表现出强烈的生长优势。其蛋白质含量普遍超亲，游离氨基酸含量和还原糖含量介于两亲本之间，或超过高亲亲本。

郑岩松等（2003）研究了芥蓝以及芥蓝×菜薹种间杂种后代对芜菁花叶病毒（TuMV）油菜株系的抗性。结果表明，芥蓝对广东省广州地区TuMV油菜株系具有近于免疫的抗性。芥蓝×菜薹种间杂种回交后代抗TuMV油菜株系的选择效应受回交亲本影响很大：用抗病品种与杂种回交的后代，经两次系统选择后，已获得16个经济性状较好的抗病品系；但用感病品种与杂种回交两代之后，抗病性明显下降。

三、物理化学诱变在菜薹种质创新中的应用

诱变育种是利用理化因素诱发植物发生变异，通过选择育成新品种的方法。

尚爱芹等（1999）利用不同浓度的秋水仙素对二倍体菜薹种子和幼苗生长点进行不同时间长度的浸泡，结果表明，用0.1%秋水仙素水溶液处理幼苗生长点48h的诱变效果最好，诱变率可达26.67%，浸泡种子效果不佳，最高诱变率仅为4.0%。四倍体植株结籽率较二倍体明显降低，平均达42.3%，而八倍体植株几乎是完全不育的。随着染色体组的增加，花粉粒大小和叶片保卫细胞中的叶绿体数均显著增加，与二倍体（CK）比较，四倍体植株生长旺盛，花薹的产量和品质均有所提高。

廖飞雄等（2001）利用60Co-γ射线辐射菜薹种子，发现对预先浸泡1h的菜薹种子来说，适宜的处理剂量为200～300Gy。廖飞雄等（2003）对60Co-γ射线辐射后的菜薹器官进行离体培养时，发现对菜薹种子的适宜辐射剂量是200Gy左右，经过催芽的种子适宜剂量为50～100Gy，离体培养茎尖可用40～70Gy。

四、生物技术在菜薹种质创新中的应用

（一）体细胞变异体离体筛选

组织培养得到的再生植株以一定频率发生变异是一种普遍的现象，这便是利用植物体细胞变异体离体选择法对作物现有品种进行有限的修饰与改良的基础。通过这种方法，已成功地筛选出耐盐水稻、抗稻瘟病细胞突变体、抗除草剂大豆等一系列有价值的突变体，在作物遗传改良方面发挥了重要作用。在植物耐热性筛选研究中与传统的耐热性选择方法相比，离体筛选方法具有不受季节和气候条件限制、变异范围广、选择群体大、节省土地和人力等特点，可显著提高种质资源创新的效率。

何晓明等（1999）进行了菜薹耐热性离体筛选的研究，结果表明，耐热性不同的菜薹品种对离体培养中的热胁迫反应亦有所差异，35℃培养30d的无菌苗存活率可以作为菜薹耐热离体筛选的选择指标。通过热胁迫交替选择，从热敏菜薹品种中，初步筛选出3个耐热无性系A -2、B -1、B -8。这些无性系耐热品系在热胁迫中的茎尖存活率基本保持在60%～80%，而未经筛选的无性系茎尖的存活率平均仅为20. 83%，因此经过筛选的无性系的耐热性有了明显改善。同时还发现，经9 代培养和4次热胁迫筛选，这3个无性系的耐热性均表现比较稳定，表明这种耐热性可以在无性繁殖过程中传递下去。通过热胁迫选出的无性系其茎尖繁殖系数也较原群体有所提高。

廖飞雄等（2003）在离体筛选耐羟脯氨酸变异的研究中，发现对菜薹茎尖和愈伤组织来说，经0.3mg/ml的羟脯氨酸3～4个周期筛选后，可获稳定抗性株系。菜薹种子萌发后的幼苗在1.0mg/ml浓度上，经4个世代连续筛选可获抗性株系。3mg/ml浓度可用于幼苗的前期淘汰。入选系耐羟脯氨酸的能力和耐热性提高。廖飞雄等（2004）利用“六十天特青，离体筛选出的一个菜薹耐羟脯氨酸选择系Hypr01，发现在人工气候箱模拟栽培高温逆境下，Hypr01和未经选择的六十天特青相比，有较强的耐热性。

（二）基因工程

徐秉芳等（1996）研究报道紫菜薹的花粉经低温水合、热激、渗激三步程序，分离出大量具萌发能力的脱外壁花粉，脱外壁率可高达60%以上。在含有碳源与氮源及Roberts 培养基盐成分的碱性PEG培养基中，首次使芸薹属脱外壁花粉萌发，萌发率可达41%。这使得利用花粉作为外源基因的媒介进行植物遗传的转化有了重要的突破。

施华中（1995）以花粉特异启动子Zm13-260 控制的Gus 基因作为报告基因，用电激法分别转化紫菜薹花粉原生质体和花粉粒，通过瞬间表达检测，比较了二者的转化效果。结果表明，花粉原生质体的电激导入效果比花粉粒高，前者的Gus 基因瞬间表达水平远远高于后者，Gus 基因活性是后者的10倍。并探讨了Gus 基因在不同发育时期花粉原生质体中的时序表达特性，花粉愈幼嫩，Zm13 的启动活性愈低。

张国裕等（2006）以建立的菜薹高频再生体系为基础，利用GUS染色组织分析法研究了根癌农杆菌菌株、乙酰丁香酮（A S）、预培养时间、浸染时间和共培养时间等因素对菜薹（B rassica camp estris L. var. pchinesis）子叶遗传转化的影响，探讨了适宜菜薹转化的卡那霉素与抑菌抗生素使用浓度。结果表明，农杆菌菌株A GL0 对菜薹的浸染能力最强，添加乙酰丁香酮有利于菜薹转化；子叶外植体预培养2d 后浸染（菌液浓度OD 600值为0.8）15min，共培养2d，然后转移到含15mg/L 卡那霉素和100mg/L T icarcillin 的筛选培养基上，进行转化植株的再生，植株再生率及外植体GUS 阳性率均较高，是较优的转化条件；该试验共获得8 株转化植株，转化率达2.44%，经PCR分析和Southern 杂交检测表明，Gus基因已整合进入菜薹基因组。

张扬勇等（2003）通过对农杆菌介导法将韧皮部特异表达启动子RSs-1（Rice sucrose synthase-1，水稻蔗糖合成酶）与雪花莲凝集素（Galanthus nivalid agglutinin，GNA）基因构成的嵌合基因转化菜薹，获得转基因植株。该试验目的是利用雪花莲凝集素对刺吸式昆虫有较好的抗虫效果，采用延迟筛选抗生芽的方式，最终得到了抗生植株，并通过了分子检测。

通过基因工程的手段进行菜薹种质的创新还刚刚起步，随着菜薹转基因体系的逐步完善以及克隆的有用基因越来越多，该技术在菜薹种质改良中的应用将越来越广泛。

2、苦瓜种质资源的创新有什么作用？

种质创新泛指人们利用各种变异（自然发生的或人工创造的），通过人工选择的方法，根据不同目的而创造的新种、新类型、新材料。种质创新是遗传多样性拓展的重要途径，是种质资源有效利用的前提和关键，是作物遗传育种发展的基础和保证。目前，苦瓜种质资源的创新成效主要表现在经选育的地方品种的直接利用，以及以通过杂交育种等手段创造的优良新种质作为亲本材料，配制培育新的一代杂种。

在一代杂种没有大面积推广之前，中国各地的苦瓜主栽品种基本上是常规品种，因此在生产中占据着重要地位。这些常规种都是在当地地方品种或引进其他地区地方品种的基础上，经系统选育或杂交选育的优良品种。如蓝山大白苦瓜是湖南省蓝山县蔬菜研究所科技人员用蓝山鳝鱼苦瓜与蓝山鲤鱼婆苦瓜进行杂交，再从杂交后代中经连续8年系统选育而成。该品种早熟、耐热、喜湿、喜肥、抗病虫力强，品质极佳，肉质细嫩、柔软，是目前全国主要的优良苦瓜品种之一，已在全国30个省（直辖市、自治区）试种成功，并受到广大农民和消费者的欢迎。

近十多年来，中国从优良地方品种的利用逐步转向了栽培品种的杂优化选育。为了适应市场和生产的需要，各地先后育成了一批不同类型的新品种，实现了适合于不同季节、不同栽培方式（露地和保护地）、不同成熟期（早、中、晚熟栽培）以及适合于鲜食和加工等不同用途的专用品种，从而促进了苦瓜生产的发展。

在鉴定、评价的基础上，筛选、纯化种质资源以获得优良的自交系是配制杂交组合的基础。在相继被选育出的一批综合性状优良的苦瓜一代杂种中，许多都是以系统选育的优良苦瓜地方品种作为亲本。例如，湖南省蔬菜研究所选育的早中熟、高产、耐热、抗病、优质的一代杂种湘苦瓜2号，其母本是从扬子洲白苦瓜中选育的自交系，父本是从株洲长白苦瓜中选育的自交系。湖南省衡阳市蔬菜研究所选育的中早熟，主蔓雌花率高，瓜色油绿、有光泽，高抗病毒病、枯萎病、中抗霜霉病的一代杂种衡杂苦瓜2号，其母本B06是从广东省一个地方品种用双株选择法经5代自交分离选育的自交系，父本B02-5是从湖南省地方品种蓝山苦瓜的变异株经5代自交定向选育而成的优良自交系（肖昌华，2005）。湖南省农业科学院蔬菜研究所选育的春燕苦瓜表现为极早熟，瓜棒形，皮色翠绿，味稍苦，商品性好，早期产量高。其母本是从广东省地方品种江门大顶苦瓜中发现的一个突变株，经7代自交分离，定向选育的自交系。父本是从贵州地方品种独山青皮苦瓜经5代自交定向选育而成的自交系（粟建文，2005）。大肉2号苦瓜是广西自治区农业科学院蔬菜研究中心培育的一代杂种，中熟偏早，产量高，瓜长圆筒形，皮色浅绿，光滑油亮，大直瘤，肉质甘脆，品质佳，较耐白粉病。其母本C10-26是由泰国曼谷苦瓜经7代自交分离选育的优良自交系，父本S5是从广西自治区地方品种苏圩苦瓜经5代自交分离选育的自交系（方锋学，2003）。

丰富的种质资源是种质创新的物质基础。苦瓜以其特殊的营养成分和药理作用决定了其潜在的应用价值。尽管目前苦瓜种质资源的创新利用水平还较低，然而随着日新月异的分子生物学技术和现代生物技术的发展，以丰富的苦瓜种质资源及其野生近缘种为材料，在筛选、鉴定、评价的基础上，深入地开展苦瓜优异种质资源创新及优异基因挖掘等研究，不仅将大大提升苦瓜种质资源研究水平，而且也将为苦瓜育种和生产的可持续发展奠定坚实的基础。

3、黄瓜种质资源创新有哪些？

（一）通过远缘杂交创新种质

黄瓜（Cucumis sativus L.）与甜瓜（C.melo L.）的种间杂交长期以来很受人们重视，因为甜瓜具有黄瓜所缺乏的对某些病原体的抗性。如果杂交成功，将极大地丰富黄瓜的基因。但在栽培黄瓜与甜瓜及其野生种之间的杂交很难成功。Ondrej等报道（2001），由于受精后的障碍，栽培甜瓜和黄瓜正反交杂种的胚只能发育到球形胚阶段。由于体细胞的不亲和性，甜瓜×黄瓜的体细胞杂种细胞在愈伤组织阶段就停止了分裂（Jarl et al.，1995）。迄今为止，国内外研究者对黄瓜属两个栽培作物之间的种间杂交还未取得成功。关于黄瓜属栽培作物与野生种之间的种间杂交，大多数的杂交只进行到胚这一阶段。除了Chen等（1997，1998）的报道外，其他关于获得种间可育F1的报道都难以重复。

Chen等（1997）首次报道了采用胚胎拯救方法，利用野甜瓜（Cucumis hystrix Chakr.）（2n=2x=24）与栽培种黄瓜进行种间杂交获得成功，且得到了不育的后代（2n=19）。为了恢复育性，在正反交的基础上，应用体细胞无性系变异（somaclonal variation）通过进行染色体加倍，经过育性恢复筛选，获得了一种有商业开发前景的甜瓜属双二倍体新种质（Chen et al.，1998）。新种质被定名为Cucumis hytivus（Chen and Kirkbride，2000），其基因组为HHCC（H和C分别代表C.hystrix和C.sativus的基因组），染色体数为2n=4x=38。新种质在露地和温室都表现出旺盛的结果能力，每株可结果30个左右，常常2～3个果结在同一节上，果型整齐，可一次采收，适用于腌制类型黄瓜品种的选育。果实细长，基本无种子，果重约50～100g，果长约10cm，果型指数3.3；嫩果绿色，除黄瓜味外还稍有柠檬味，蛋白质和矿物质的含量分别为0.78%和0.35%，均分别高于普通黄瓜含量0.62%和0.27%。同时，新种质抗白粉病，对南方根结线虫的抗性介于野生种酸黄瓜和栽培黄瓜之间，当杂种作为供体亲本与栽培黄瓜进行回交时，抗性被进一步转移到回交一代中（陈劲枫等，2001）。新物种的光补偿点为11.25μE/（m2s），低于以往报道的耐弱光品种长春密刺。弱光处理2周后，新种的叶绿素a和叶绿素b含量增加，叶绿素a/b的值大幅度降低，形态学耐弱光隶属值高达0.946，说明杂交新种耐弱光能力很强（钱春桃等，2002）。

表15-5 甜瓜属栽培种和野生种的种间杂交

陈劲枫等（2003）将种间杂交获得的异源三倍体与栽培黄瓜北京截头杂交，经过胚挽救获得了两个2n=15（14C+1H）的单体附加系02-17和02-39。前者植株叶形为掌状形，后者为深陷的掌状形，并且果实均为白色，不同于异源单倍体的掌状心脏形和黑刺，果形比异源三倍体黄瓜更长接近普通黄瓜。细胞学和RAPD分析发现，上述附加系附加了野生种Cucumis hystris的染色体。

（二）通过种内杂交创新种质

黄瓜属变种间的基因交流比种间容易得多。黄瓜的野生变种与普通栽培种相互杂交可育，因此，多年来国内外育种家一直致力将野生变种中的分枝性强、结果数多、高抗某些病虫害等优良基因转移到栽培品种中。

Deakin等（1971），Staub和Kupper（1985a）都曾采用野生黄瓜（C.sativus var.hardwickii）与栽培黄瓜杂交的方式创造新的种质。野生黄瓜的一个株系LJ90430比栽培黄瓜植株大，侧枝多，种子小，具短日照习性，在北加州秋季气候条件下，LJ90430株系通常每株能产约80个成熟果实（Horst and Lower，1978）。该株系被广泛运用在育种计划中，并且先后获得了一系列具有改良性状的优异种质（Staub，1985b，1992；Peterson，1986）。

Walters等（1997）利用野生资源LJ90430与栽培种质杂交、回交和自交，创新出了抗北方根结线虫和爪洼根结线虫的系列种质NC42～NC46。

Simon 等（1997）以美国种质SMR18为母本，西双版纳黄瓜为父本，进行回交，选择果肉颜色深的半姐妹系，通过3代的姐妹交和混合选择，获得后代材料104，后继续姐妹交和选择，获得了新种质LOM 404，其胡萝卜素含量最高可达15mg/kg。以美国种质Addis为母本，西双版纳黄瓜为父本，进行回交，通过3代的姐妹交和混合选择，获得后代材料101，用104与101杂交后，经连续五代自交单株选择和一代混合选择获得新种质EOM 400和EOM 402；其胡萝卜素含量高达25mg/kg（图15-10、15-11）。

图15-10 高胡萝卜素黄瓜种质的创新

图15-11 高胡萝卜素黄瓜种质LOM 404的4个成熟果实的纵切面

国内外黄瓜育种家，利用对各自掌握的种质资源，通过类型或品种间杂交，育成了大批抗病、抗逆、优质、高产、熟性各异的自交系和雌性系，促进了黄瓜品种的杂优化。例如，卓齐勇等（1988）于1975年从引进的早龙和黑龙第二代植株中发现全雌株、强雌株和普通株3种类型。早代利用强雌株的雄花授予全雌株的雌花上，晚世代结合赤霉素诱雄和自花授粉，选育出全雌株率达到94.4%～100%的雌性系奥早和黑龙选。之后，利用回交转育的方法，以奥早和全青为亲本，以优质抗霜霉病的全青为轮回亲本，连续回交3～4次获得全青的优良性状，然后在经过2～3代自交，获得一系列雌株率在90%以上的优良雌性和强雌性株系，其中奥早75和奥早82为优质、早熟、抗病的雌性系。1995年，卓齐勇等又用82雌性系作母本，大悟大吊瓜作回交亲本，进行杂交并回交一次，经过7代的抗病性筛选，选育出抗疫病、霜霉病、炭疽病、细菌性角斑病等5种病害的82大雌性系。尹彦、李锡香等利用国内外不同类型的黄瓜种质通过杂交、添加杂交和系统选育创新出全雌性和复雌性黄瓜新种质G5224和EF1613。G5224是由国外品种Branex（F1）的自交分离群体所选单株与北京刺瓜的自交系（S5）杂交，经多代系统选择得到优良自交系后，又与引自美国的5207杂交，再经多代系统选择而育成。该自交系结合了北京小刺、欧洲品种和美国品种的优点，表现全雌性、早熟、坐果率较高，果实商品性好，瓜长30cm左右，瘤刺大小和稀密中等，瓜色深绿，有光泽，无黄色条纹，心室较小。植株耐低温，苗期在10℃和3000lx光照条件下处理15d后幼苗成活率为92.2%，比对照新泰密刺高16.4%，抗角斑病、枯萎病、黑星病、白粉病，耐霜霉病和灰霉病。EF1613是以编号为 373/85的国外黄瓜品种与北京刺瓜杂交，经4代纯化选择，得到优良株系后，又与来自东北地区的一个地方品种8970杂交，经过多代选择，最终形成EF 1613品系。该品系长势强健，雌花多，坐果率较高，以主蔓结瓜为主，侧蔓数量不多，果实商品性好，瓜长30cm左右，瘤刺大小和稀密中等，瓜色深绿，有光泽，无黄色条纹，心室较小。植株高抗黑星病，抗角斑病、枯萎病、白粉病，中抗根结线虫，耐霜霉病。利用上述优异种质，培育出雌性和强雌性黄瓜杂交一代系列中农202、中农203、中农208等。

利用常规方法进行种质改良的研究较多，在此不再赘述。

诱变育种就是利用物理因素（如X射线、γ射线、紫外线、激光等）或化学因素（亚硝酸、硫酸二乙酯等）来处理生物，使生物发生基因突变。从而在短时间内获得更多的优良变异类型的育种方法。

陈劲枫等（2004）利用0.4%的秋水仙碱浸萌动的黄瓜种子，染色体加倍率可达26.7%。与原二倍体相比，同源四倍体的侧枝数减少，叶柄变短，叶面积增大，花器变大，果型指数减小。四倍体花粉的可染率和萌发率均显著降低。

雷春等（2004）通过辐射剂量为200 Gy或300 Gy的C射线辐射花粉授粉并结合胚培养，从3个基因型黄瓜中获得了单倍体植株。与正常二倍体植株相比，单倍体植株生长缓慢，花器异常。研究同时发现辐射剂量、亲本基因型、授粉组合对坐果率和单倍体产率有一定影响。

图15-12 黄瓜自交系CHA03210搭载前后植株叶片变异

1.CHA03210搭载前后叶片大小 2.CHA03210搭载后部分自封顶（引自余纪柱等，2007）

李加旺等（1997）利用23.22C／kg60Co γ射线辐射处理具有某些优良特性的黄瓜自交系种子，并在其变异后代群体中，筛选出两个综合性状优良的单株。经3代系选，从中分选出一个主要性状均能稳定遗传的株系辐M-8。该株系集几种优异性状于一体，用其为亲本与另一高代自交系配制出适于日光温室栽培的耐低温、弱光杂交一代组合：93-黄瓜新品系。

图15-13 黄瓜自交系CHA03210搭载后变异株自交后代果实的变异

陈劲枫等（2004）在室温条件下，用0.2%、0.4%、0.8%的秋水仙素水溶液分别处理黄瓜津绿4号干种子和萌动种子。结果表明，0.4%的秋水仙素浸萌动种子4h的染色体加倍效果最好，加倍率可达26.7%。与原二倍体相比，同源四倍体的侧枝数减少，叶柄变短，叶面积增大，花器变大，果型指数减小。四倍体花粉粒大小不一，每一朵花中平均有2.3%的4孔花粉粒；四倍体花粉的可染率和萌发率均显著降低。

航天诱变是诱变的一种特殊形式，是利用卫星或高空气球携带、搭载植物种子等生物体样品，经特殊的空间环境条件（强宇宙射线、高真空、微重力等）作用，引起生物体的染色体畸变，进而诱发生物体遗传变异，经地面种植选育试验后，能快速而有效地育成作物的新品种（系），供生产上推广利用，可广泛应用于各种植物的遗传改进。这种技术也为黄瓜种质创新开辟了新途径。余纪柱等（2007）利用卫星搭载黄瓜自交系材料，通过地面种植、观察，当代植株即发生了叶片大小和株型自封顶变异，经过自交分离，后代果实大小、果形指数、雌花节率和每节雌花数发生较大变异，经纯化获得特小型黄瓜自交系CHA03-10-2-2。该自交系瓜长8cm左右，雌花节率达99.5%，表现稳定，可直接用于培育特小型黄瓜新品种。

（四）利用细胞工程和基因工程创新种质

细胞工程是应用细胞生物学和分子生物学方法，借助工程学的试验方法或技术，在细胞水平上研究改造生物遗传特性和生物学特性，以获得特定的细胞、细胞产品或新生物体的有关理论和技术方法的学科。广义的细胞工程包括所有的生物组织、器官及细胞离体操作和培养技术，狭义的细胞工程则是指细胞融合和细胞培养技术。植物细胞工程包括：植物组织、器官培养技术，细胞培养技术，原生质体融合与培养技术，亚细胞水平的操作技术等。目前，细胞工程技术在黄瓜种质创新中的应用主要集中在大孢子培养、原生质体培养和体细胞融合等方面。

据杜胜利（2004）介绍，天津科润黄瓜研究所“利用分子标记和单倍体技术创造黄瓜育种新材料研究”项目通过了天津市科委组织的技术鉴定。该项目通过对黄瓜雌核发育机制研究、黄瓜离体雌核发育培养体系、黄瓜染色体倍性鉴定及加倍技术研究，建立了一套高效、稳定的黄瓜未受精子房培养的技术体系，再生频率达25%。研究和建立了一套简单、快速而有效的倍性鉴定方法，筛选出诱导黄瓜单倍体、双单倍体染色体加倍的有效办法，加倍频率达16.9%。据孙日飞（2005）的进一步介绍，黄瓜大孢子培养以开花前2～3d为接种的最佳时期，以Miller为基本培养基，以AD或ADS为细胞分裂素，以蔗糖为首选糖源。无菌材料经横切或纵切后，接种至诱导培养基三角瓶中，后转至培养室培养：并以25℃黑暗条件培养7d，然后移至等温度14h/10h（光照/黑暗）条件下培养为最好。该技术已基本成熟，并已以此培育出了植株。

黄瓜由子叶、真叶和胚性悬浮培养细胞等材料的原生质体培养已成功（吕德扬等，1984；刘少翔等，1991，贾士荣等，1985，1988；Punja等，1990），但是再生植株相对困难。

为了获得再生植株，张兴国等（1998a）对黄瓜原生质体分离和再生条件的研究表明，7日龄初展黄瓜子叶和15～17d的真叶，在1%纤维素酶、0.5%离析酶和0.25～0.30mol／L甘露醇混合酶液中，均分离出大量原生质体，转入附加1mg／L BA和0.5mg／L 2，4-D的改良KM培养基（去除NH4NO3）中浅层液体培养，形成微愈伤组织。由成都二早子黄瓜真叶原生质体愈伤组织培养的胚状体和子叶原生质体愈伤组织诱导的不定芽，都培育出了小植株。

张兴国等（1998b）将黄瓜子叶原生质体来源的愈伤组织在1.0mg／L BA和0.05mg／L NAA的MS固体培养基上再生绿苗，经生根成为完整植株。10μg／ml诺丹明6G（R6G）处理15min或1.5mmol／L碘乙酸（IOA）处理10min，均能有效地抑制黄瓜原生质体分裂。分别经R6G和IOA生理性失活的原生质体经PEG和高钙高pH法融合后可恢复分裂生长。由4个黄瓜种内组合得到了愈伤组织。部分愈伤组织分化了根，部分愈伤组织经酯酶同功酶分析确定为体细胞杂种。

基因工程技术在黄瓜种质创新中的应用也有了一些进展。国内报道了采用介导外源DNA的方法改良黄瓜种质的试验。邓立平等（1995）曾报道以抗霜霉病津研4号黄瓜为供体，丰产感病黄瓜长春密刺为受体，于人工辅助授粉后12～24h，采用微注射法通过柱头将外源DNA注入受体子房，从而导入了外源基因，获得了稳定的突变新品系CJ90-40。

邹长文（2004）将冷诱导基因cor15a基因和转录因子CBF3基因同时导入黄瓜基因组，并通过了植物基因组DNA的PCR检测和Southern杂交检测。PCR检测结果表明有4株植株携有cor15a基因，有3株植株携有CBF3基因，其中只有2株携有双基因。转基因植株的Southern杂交结果证明两株携有双表达盒的转基因植株中，其中1株的目的基因拷贝数为2，另一株为1个拷贝，证明目的基因已经导入黄瓜基因组中。

4、瓠瓜的种质资源创新包括了哪些方面？

由于瓠瓜栽培面积较小，对其种质资源的创新利用尚处于起步阶段。

在瓠瓜种质的创新中，目前主要采用系谱选择的方法，即选择遗传性状不同的瓠瓜种质资源，通过人工杂交，后代选择自交纯化的方法，获得优良自交系或品种，创造新的种质。浙江省宁波市农业科学院蔬菜研究所以地方品种“宁波夜开花”为材料，经多代自交选择，培育出了自交系94-04-3-1，其特点是植株生长势中等，分枝性强，单株坐果数多，连续结果性好；商品瓜表皮绿色、长棒形，长约50cm，横径约4.3cm，瓜顶部尖圆。以宁波地方品种与国外品种杂交后经多代回交、自交选择育成商品性好、优质的稳定自交系NC94-4-09-15，该自交系表现为熟性早，生长势强，较耐低温，抗逆性强。瓜长约50cm，横径约4.9cm，瓜皮绿色，瓜顶部钝圆。浙江省农业科学院蔬菜研究所针对瓠瓜设施栽培中低温、弱光照等主要限制因子，通过室内外耐冷性鉴定及保护酶活性、叶绿素荧光参数等生理指标测定和筛选，定向选择培育出了耐低温、耐弱光的优良自交系，并应用于瓠瓜杂交一代新品种的选育。

广东省农业科学院蔬菜研究所（2001）在大田里发现3株瓠瓜雄性不育株，研究表明瓠瓜雄性不育有3种类型：一是花药退化型，花药高度退化，大小仅为正常植株花药的1/3或更小，内无花粉，为完全雄性不育；二是无花粉型，花药大小接近正常，但无花粉，为完全雄性不育；三是花粉减少型，花药大小正常，且有花粉，但花粉量少，不到正常植株花粉量的1/2，自交可育，后代出现育性分离。该所正利用上述不育材料进行三系配套研究。

5、什么是林木种质创新

利用杂交育种、倍性育种、细胞工程、基因工程等技术手段，创造具有新性状、基因型等林木种质资源的过程。

6、胡萝卜种质资源创新包括哪些方面？

种质资源创新的途径较多，如突变体筛选、单倍体培养、种间杂交、原生质体融合、优异基因聚合、转基因等。这些方面已在胡萝卜研究中取得了一定的进展。

（一）体细胞无性系突变体筛选

早在20世纪40年代前，人们就已发现植物在细胞或组织培养过程中会产生遗传退化，形态改变，染色体数及倍性发生变化等。1981年，Larkin和Scowcroft首次提出体细胞无性系变异（Somaclonal variation）这一术语，激起了众多学者的研究兴趣。胡萝卜是最早作为组织培养研究的模式作物之一，特别是在体胚发生途径方面取得了重大进展。同时不少学者在此研究过程中也发现了不少突变体，这对特异基因表达、定位及生理研究提供了重要研究材料。

Koyama等人（1990）通过筛选获得一个胡萝卜突变系（Insoluble phosphate grower，IPG），可以释放出大量的柠檬酸到含有磷酸铝培养基中，而且其生长速度比野生型快。通过深入研究表明突变系中NADP专一异草酸脱氢酶（NADP-specific isocitrate dehydrogenase，NADP- ICDH）的活性比野生型低一半，降低了异柠檬酸向酮戊二酸的转化，进一步影响了柠檬酸向异柠檬酸的转化，从而引起胡萝卜突变系中柠檬酸大量积累。Nothnagell and Straka（2003）获得了一个黄色叶片的突变株系，通过杂交后代F2和F3的观察，表明黄色叶片是由单个隐性基因（yel）控制的，并筛选到了10个与其紧密连锁的AFLP标记。Lo Schiavo（1988）等人在大量胡萝卜细胞突变体中获得了一个温度敏感型的胚胎发生株系ts59，表现在球形胚时期就停止发育，外源IAA也不能激活，在其发育过程中产生大量的热激蛋白（Heat-shock proteins）。

（二）单倍体培养

自从Guha and Maheshwari（1964，1966）首先获得曼陀罗单倍体植株（Haploid plant）以来，单倍体研究快速发展，目前已在几百种植物中获得了成功。中国在小麦、大白菜、甘蓝、辣（甜）椒等作物中取得了很大成功，并培育出了新的优良品种。有关胡萝卜单倍体培养的研究报道较少。Matsub等（1995）将胡萝卜未成熟花药按不同时期（四分期、早期单核期、后期单核期）分别接种到含有不同浓度激素的MS和B5培养基上，三个时期的花药都获得了愈伤组织，但只有四分期的花药获得了不定胚，比例也很低（1.8%～4.3%）。将游离小孢子接种到NLN和1/2MS培养基上获得了小愈伤组织，但未能进一步分化。

（三）原生质体非对称融合

胡萝卜原生质体非对称融合研究最早开始于20世纪80年代。Dudits等人（1980）利用X射线辐射欧芹叶片原生质体，和从白化变异的胡萝卜细胞悬浮系分离的原生质体进行融合，结果获得了染色体数为2n=19，叶片绿色的非对称杂种植株。Ichikawa等人（1987）实现了野生种Daucus capillifolius与栽培胡萝卜的融合，获得了胞质杂种。对其提取线粒体DNA进行限制性酶切，发现再生植株的线粒体带型出现了不同于双亲的特异带。

Dudits等人（1987）利用γ射线辐射处理胡萝卜悬浮细胞系，与烟草的叶片原生质体进行融合，获得了远缘体细胞非对称杂种。杂种后代具有烟草的形态特征，同时又具有胡萝卜的一些抗性。通过对其线粒体DNA和叶绿体DNA的限制性酶切图谱分析，杂种的叶绿体DNA图谱与烟草高度一致，而线粒体DNA出现了特异带，表明胡萝卜线粒体基因组和烟草的基因组发生了重组（Smith et al.，1989）。

Kisaka等人（1994）通过非对称融合实现了单子叶植物水稻（Oryza sativa L.）与胡萝卜间的融合。再生杂种植株具有胡萝卜的形态特征，同时又具有水稻5-MT（5-methyltryptophon）的抗性，其染色体数为20～22，远小于双亲的染色体数之和。通过分析线粒体DNA和叶绿体DNA的限制性酶切图谱，发现杂种叶绿体基因组与胡萝卜高度一致，线粒体基因组间发生了重组。通过染色体鉴定和同工酶进一步分析，尽管对胡萝卜进行辐射处理，但杂种中胡萝卜的核物质占多数，水稻的核物质占少数，出现了受体染色体大量丢失现象。

Tanno-Suenaga等人（1988）利用X射线辐射胡萝卜褐药型不育材料28A1的原生质体，与可育材料K5进行融合，成功获得了新的不育材料。对再生植株的线粒体DNA进行限制性酶切分析，同样发现了线粒体基因组间的重组现象。随后，Tanno-Suenaga等人（1991）又用瓣化型不育材料31A的原生质体通过PEG介导与可育材料K5进行融合。一次融合后获得再生植株均为胞质杂种，不过未表现出瓣化不育特征，但通过两步融合法实现了瓣化型不育性在种内的转移，他们认为这可能与融合双亲的基因型有关。

司家钢等（2002）利用紫外线辐射处理胡萝卜瓣化型不育材料7-0-8的原生质体，与可育材料66-3进行电融合，获得了33株再生植株，通过RAPD标记鉴定，均为胞质杂种。通过对其中4个再生植株进行花期形态学鉴定，全部表现为雄蕊瓣化型。

（四）种间杂交

目前已有许多研究成果表明胡萝卜种间杂交不存在交配障碍（McCollum，1975；Nothnagel，1992；Nothnagel and Straka，1994），其中橘红色胡萝卜可能就是由紫色胡萝卜与野生种ssp.maximus杂交演变而来的。另外，胡萝卜商品种子在繁种过程中经常会受到野生种花粉的污染，从而产生一些杂种种子（Small，1984）。使用最多的瓣化型雄性不育系也是来自于胡萝卜属Daucus carota L.野生种（McCollum，1966）。

野生胡萝卜D.carota ssp.gummifer Hook.fil.和栽培胡萝卜杂交产生了一种异源胞质的橘色胡萝卜，在这种胡萝卜中发现了一种新的CMS类型，称作GUM类型，其特征是花药和花瓣的总量减少（Nothnagel，1992）。最近的研究结果表明其遗传机制是gummifer细胞质和细胞核中的一个隐性基因位点（gugu）相互作用控制这种类型雄性不育性的表达（Linke et al.，1994）。由于其遗传模式较为简单，因此这种不育类型可能会成为胡萝卜育种的一种新的CMS资源（Linke et al.，1994）。

Nothnagel et al.（2000）在此基础上又进行了多种野生胡萝卜种或亚种与栽培胡萝卜间的杂交和回交研究，并获得了其他两种具有应用潜力的新型不育资源MAR和GAD。MAR类型来源于D.carrot ssp.maritimus，属瓣化类型，花瓣白绿色，雄蕊变成“勺子”结构，而其回交后代的雄蕊也呈现出瓣化类型。GAD来自于D.carrot ssp.gadecaei，雄蕊只有花丝结构表达，其他器官发育正常。遗传研究表明这两种类型控制雄性不育性表达的核上基因可能不至一个。

Cole（1985）、Ellis等人（1993）对野生胡萝卜种D.capillifolius的抗性进行评价，认为其对胡萝卜茎蝇（Psila rosae L.）具有较高抗性，通过6代选择之后，获得的株系抗性不如其野生亲本高，但比从较抗的Sytan选择的株系明显要好。

（五）优异基因聚合

虽然种间杂交、原生质体融合及转基因等手段可跨越种或属间的杂交障碍，但是杂交后代为生产所利用往往需要经过漫长的过程。目前许多学者又专注于地方品种资源的有效利用，由于地方品种种类多，存在不同抗性，而且通过对不同种质资源的广泛杂交、筛选，可获得新型的种质，并可直接为育种者所利用。

目前生产使用最多的黑田五寸，是由日本学者将日本本地红色类型与欧洲引进的橘红色类型杂交筛选获得的。在20世纪50年代，国外学者就开始进行胡萝卜种内杂交的研究，并筛选出了大量抗性株系。中国在20世纪80年代开始相关工作，但主要集中在瓣化型雄性不育的转育，通过多代回交获得新的雄性不育系和保持系，再进行配组培育一代杂种。但是由于缺乏良好的杂交技术，国内关于胡萝卜可育系之间的杂交研究一直未开展，因此也难以实现地方资源优异基因的聚合，故有必要深入开展此方面的研究工作。

7、西瓜种质资源有哪些创新？

（一）自然突变

生产和育种过程中，由于自然环境条件下不确定因素的作用，一些西瓜材料常常产生自然的基因突变，表现出特异的性状，颇有研究和利用价值，成为西瓜种质资源创新的一条很有价值的途径。比如国内的无杈西瓜、板叶西瓜大叶红、西瓜G17AB雄性不育两用系、西瓜子叶失绿致死基因的携带株等都是从自然突变中得到的。

（二）杂交创新

两个或多个具有不同优良性状的种质进行杂交，对分离后代逐代选育出一个综合性状优良的新品种或新种质，这是常规品种选育的主要途径。比较熟悉的一些常规西瓜品种选育如：

小花狸虎×旭大和——早花

早花×华东24（♀）——龙蜜100×蜜宝——龙蜜104、龙蜜105

早花×红枚（♀）——中育1号×庆丰——汴梁1号

早花×核桃纹——郑州2号×兴城红——郑州3号×中育6号——石红1、2号

庆丰×蜜宝——中育2号×手巾条——中育9号

手巾条×久比利——中育5号×中育6号——中育10号

20世纪80年代以后，随着杂交一代西瓜的兴起，这种育种方法逐步成为西瓜种质创新的主要途径。

肖光辉等（1998）报道，用常规杂交转育的方法将野生西瓜的抗枯萎病性状转育到栽培西瓜中，后代在病圃中经7代自交纯化和抗性选择，选育出了4份抗性材料。苗期接种鉴定和疫土自然接种鉴定的结果都表明，选育出的4份材料中，对西瓜枯萎病有2份高抗、2份中抗，对炭疽病的抗性均较强等。

（三）诱变创新

包括化学诱变和物理诱变，主要有以下几个方面：

1.化学诱变

以秋水仙素诱变西瓜四倍体最为典型，诱变方法不断改进。谭素英等（1993）采用剥去生长点外幼叶、进行秋水仙液滴芽的方法诱变西瓜四倍体，变异株率可提高到50%～60%。房超等（1996）以幼胚子叶组织为外植体，0.05%的秋水仙液浓度进行西瓜离体诱导四倍体的诱变，变异株率高达50%～60%。马国斌等（2002）研究认为：采用西瓜茎尖离体诱导四倍体的有利途径是8d左右苗龄的茎尖，诱变培养基应保持较低的细胞分裂素浓度和0.1%秋水仙素浓度，处理时间为24～48h。

2.60Co γ照射

黄学森等（1995）用60Co γ照射中育1号西瓜种子（剂量376Gy，剂量率0.94～1.98Gy/min），获得1份轻抗枯萎病和1份无杈的突变材料。

王恒炜等（2003）利用60Co γ射线辐射处理118西瓜干种子，通过7代连续系统选择、鉴定，选育出了新突变系C68-42-10-9-23-73-82。该突变系表现为中晚熟，植株生长势强，抗枯萎病，果实圆形，底色浅绿，上覆中宽深绿条带，果形指数1.01，平均单果重6.4kg，粉红瓤，中心含糖量10.8%，耐贮运，种子大片，为淡红色麻籽，千粒重98g。

王鸣、马克奇等（1988）对原始易位系旭大和及其他几个优良品系的干种子用60Co γ射线进行重复照射，进一步提高其不育性，并育出一批杂合易位少籽西瓜新品种，其单瓜种子产种量较普通二倍体减少50%～80%，种子数量最少的单瓜中仅含十余粒至数十粒种子。朝井小太郎、吴进义等（1987、1993）用不同剂量的60Co γ射线辐照二倍体西瓜的干种子、花粉后代，结果各个剂量均可出现染色体易位，并选出易位纯合体，培育出华知A雄性败育系和少籽西瓜易红1号、5号等。

3.质子束辐射

孙逊等（2002）用不同能量（4、6、8mev）和剂量（25、50、100c）的质子束辐照西瓜干种子的诱变研究发现，质子辐照可诱发有丝分裂行为异常，染色体结构变异——产生微核、染色体桥、染色体断片等；随着质子束能量和剂量的提高，染色体畸变细胞率呈增加趋势；质子束还能引起雌花着生节位的降低、果实提早成熟和瓤质改善。同时，选育出了2份有价值的突变材料。

4.太空搭载育种

方晓中（2002）利用卫星搭载诱变技术处理西瓜干种子，通过太空辐射和微重力双重作用所产生的遗传变异，选育新品系、培育新品种。试验表明，太空处理过的种子在当代种植时基本无变化，F2代以后开始表现不同程度的返祖、染色体加倍、果个变大、品质提高、抗性增强等变异，在搭载的5份材料中，高桥4号变异最明显，果个比原来增大了20%，并培育出了卫星2号（高桥4号×平5♀）西瓜杂交新品种。另外，崔艳玲等（2004）培育出了航兴1～3号几个西瓜杂交新品种。

1.单倍体培养

中国在西瓜单倍体培养方面很早就有成功报道，比如薛光荣等（1988）分别用琼酥和周至红的花药诱导培育成了植株。诱导的关键是选择小孢子发育在单核靠边期时的花蕾（花蕾横径为5mm左右，花冠明显突出，花药增大，质地硬实，易于剥离），去分化培养基上花药裂口处必须能分化出致密的愈伤组织。但后来却未见成功的应用报道。

魏瑛（1999）以MS为基本培养基附加NAA、6-BA和KT，对在4℃和10℃低温下处理24h和72h的西瓜花药组织的影响及花药愈伤组织的形成作了观察。结果发现处理后的花药经过前期的褐变，在2个月时开始形成愈伤组织。其中西农8号在4℃低温下处理72h后的愈伤组织诱导率高达35.01%，NAA在花药愈伤组织的形成中起主要作用，而不同基因型材料花药的抗冻性表现出一定差异。

魏跃等（2005）以10个西瓜品种杂交后代F1的花药作为研究材料，从基因型与激素作用关系等方面对花药愈伤组织的诱导进行了研究。结果表明：适宜的基因型是花药诱导培养成功的关键因素，不同基因型对激素变化的敏感性不同，最适培养基也不相同。

2.外源DNA的直接导入

根据导入的方法不同可分以下几种：

（1）花粉管导入 李涛等（1996）应用花粉管通道导入技术将黑籽南瓜DNA导入受体西瓜早花品种，期望得到早熟、抗寒的西瓜新品系，RAPD分析表明，变异后代中产生了与早花西瓜差异明显、分子量在2kb左右的DNA片段OPY02/2000。

王国萍等（2003）利用西瓜有性生殖过程，通过花粉管通道法直接导入西瓜活体植株的技术，将携带有外源几丁质酶基因的质粒DNA涂抹在授粉后的柱头上，使其沿花粉管通道进入到生殖细胞，得到转化处理种子。转化T1代植株经除草剂Basta筛选和PCR扩增获得转化植株。对T3代株系进行田间自然发病和人工接种鉴定获得3个抗枯萎病的株系。结果表明：几丁质酶对镰刀菌引起的西瓜枯萎病有一定的抑制作用。采用的基因为几丁质酶基因（Chill）来源于水稻，构建在Ti质粒载体pCAMBAR.Chi11上，宿主菌株LBA4404，几丁质酶基因片段大小为111kb，该质粒上还含有一个Bar（抗除草剂）基因作为转基因植株的筛选标记基因。

肖光辉等（1999）采用DNA浸胚法将供体瓠瓜的总DNA导入西瓜，D1代获得一变异株，变异率为0.32%。D2代变异植株成株期功能叶过氧化物酶同工酶酶带数增加，出现了供体植株的酶带，变异株部分染色体的臂长、臂比、带型与受体相比产生了明显的变异，果实有22.7%的皮色由深绿变成白色或白皮绿网纹，接近供体瓠瓜的皮色，果实形状有31.0%发生变异：种子的形状和色泽有33.3%发生变异。初步认为西瓜的性状变异是供体瓠瓜DNA导入的结果，D3代在病圃中筛选出的D3-1、D3-2、D3-3、D3-4和D3-5材料，性状已稳定，并且在病圃中表现出对枯萎病的强抗性，苗期接种鉴定结果表明，D3-1和D3-3高抗枯萎病，D3-3和D3-4中抗枯萎病，D3-5轻抗枯萎病。

（2）子房注射法 王浩波等（2001）采用子房注射法将南瓜总DNA导入西瓜，经病圃田间筛选和6代自交纯化已获得5份稳定的西瓜抗病种质材料，对枯萎病的田间抗性得到了显著提高，有3个株系达到高抗（HR）水平。

（3）基因枪法（微弹轰击法）任春梅等（2002）以西瓜顶芽为转化受体，采用基因枪轰击的方法将质粒pBI121 DNA导入西瓜，旨在建立基因枪介导西瓜遗传转化系统。研究表明：预培养时间与轰击次数对转化率影响显著，而扩散腔类型和甘露醇处理质量浓度对转化率的影响不显著。经GUS基因表达产物的检测，Kanr（抗卡那霉素）试管苗的转化率为33.3%。

3.基因遗传转化

随着基因克隆技术不断发展，近年来成功克隆的目的基因数目不断增加，促进了西瓜遗传转化的研究。

王春霞等（1997）以2d龄的西瓜无菌苗子叶为外植体，通过与根癌脓杆菌共培，建立了西瓜子叶农杆菌介导法的遗传转化系统。所用根癌脓杆菌含有NPT-Ⅱ基因和番茄的ACC合成酶及其反义基因的质粒。Southern-blot分析，NPT-Ⅱ基因已整合到西瓜的基因组，乙烯释放指标表明，转入的正义和反义ACC合成酶基因得到不同程度的表达。

王慧中等（2000）研究表明：西瓜子叶外植体能被含双元载体pBPMWMV的根瘤农杆菌感染，该质粒载体含有一个NPT-Ⅱ基因以供选择kanr的转基因西瓜植株以及一个WMV-2 CP基因，kanr西瓜植株经NPT-Ⅱ酶活性检测、DNA分子点杂交及Southern杂交试验证明，外源的WMV-2 CP基因已导入西瓜细胞。王慧中等（2003）进一步研究表明：通过自交结合PCR检测，发现WMV-2 CP基因在转化植株自交一代的分离符合3：1的分离比。经过连续4代的选择鉴定，已从T7、T11和T32 3个独立转化子的后代中筛选获得8个转基因纯合株系，性状表现整齐一致。Western-blot分析结果表明，RT7-1、R4T11-3以及R4T32-7 3个不同来源的株系均能表达产生外壳蛋白。转基因纯合株系WMV-2感染后的病毒抗性实验表明，与未转基因对照相比，转基因株系可以推迟发病时间，减轻发病程度。实验筛选获得的转基因株系R4T32-7也表现出对WMV-2的高度抗性。

陈崇顺等（2002）利用西瓜枯萎病尖镰孢菌的孢子及细胞壁碎片混合液诱导豇豆幼苗特异几丁质酶的表达，纯化了该特异几丁质酶，测定了其部分氨基酸序列，成功克隆了对西瓜枯萎病菌等病原真菌具高抗作用的特异酶的编码基因，并与pBI121重组成功构建了几丁质酶基因植物表达载体，为培育抗枯萎病转基因西瓜迈出了新的一步。

张自忠等（2005）构建了同时含有番茄几丁质酶基因（chi3）和B-1、3-葡聚糖酶基因（GLu-AC）的双价抗真菌基因植物表达载体，以西瓜子叶块为外植体，采用根癌农杆菌介导法，将chi3和Glu-Ac同时导入西瓜栽培品种中育1号，共获得46株抗性再生植株。经PCR、Southern-blot和RT-PCR检测，表明外源基因已成功整合到西瓜基因组中，并在转录水平方面得到表达。利用尖孢镰刀菌西瓜专化型（Fusarium oxysporum）对转基因植株进行离体叶片抗病性检测，表明转基因植株对枯萎病的抗性均有不同程度的增强。

牛胜鸟等（2005）利用西瓜花叶病毒（WMV）外壳蛋白基因、小西葫芦黄化花叶病毒（ZYMV）复制酶基因、黄瓜花叶病毒（CMV）复制酶基因构建了三价植物表达载体，用根癌农杆菌介导法转化西瓜子叶外植体获得了再生植株。经PCR和Southern-blot检测，证明目的基因成功地导入了西瓜植株，并能够在后代植株中遗传，转化效率约为1.7%。在温室和大田对T2、T3代转基因株系进行了病毒接种实验和抗病性筛选鉴定，转基因西瓜株系表现出感病、抗病、免疫和症状恢复等不同的类型。其中BH1-7株系的T3代植株对ZYMV和WMV的抗病能力普遍达到中等水平以上，并保持了受体西瓜品系原有的优良农艺性状。

8、为什么要进行甘蔗种质创新？

种质创新是甘蔗育种的基础，甘蔗品种培育的突破首先在于种质创新的突破。目前，世界甘蔗栽培品种绝大部分仅含有栽培原种中的少数种的血缘（热带种、印度种、中国种、野生种的细茎野生种和大茎野生种），资源利用率不足0.1%，遗传基础狭窄、亲本近亲化现象严重，近亲繁殖后代种性退化。培育突破性品种，解决育成品种生活力、适应性、抗逆性、宿根性差等一系列问题，其根本方法是需要利用更多的新种质进行甘蔗种质创新。

9、我国对蔬菜种质资源进行了哪些创新与利用？

种质资源创新的主要目的是增加种质资源的遗传多样性和获得生产和育种所需的优异种质。按其目标的不同可分为两大类：一类是以遗传学工具材料为主要目标的种质资源创新，例如非整倍体材料、近等基因系、双单倍体系等的创建；另一类是以育种亲本材料为主要目标的种质创新（方智远、李锡香，2004）。近代以来，尤其是达尔文对物种遗传、变异的解释和自然选择、人工选择的进化理论；孟德尔的后代分离和独立分配规律；摩尔根的染色体、基因及连锁遗传理论创立以及从20世纪70年代兴起的分子遗传学，使种质资源的改良创新以及通过作物遗传育种改变其性状方面有了更多的自由（朱军，2004），也使蔬菜种质资源的改良创新及其遗传育种取得了较快进步。中国，特别是在“九五”、“十五”期间，“蔬菜种质资源的创新和利用研究”已成为蔬菜种质资源研究的重点，其进步也颇为显著。

中国从20世纪50年代开始研究甘蓝的自交不亲和系，并于60年代初由原中国农业科学院江苏分院、上海市农业科学院园艺研究所，分别在晨光大平头、黑叶小平头等甘蓝品种中进行自交不亲和系的选育，并初步获得103和105两份自交不亲和系。70年代初，中国农业科学院蔬菜花卉研究所等单位系统地开展了甘蓝自交不亲和系和杂种优势利用研究，通过连续自交、分离鉴定、定向选择的方法，先后选育成7224-5-3等具有不同熟性、不同类型的10个自交不亲和系及其配制的“京丰1号”等7个甘蓝杂交种，使中国蔬菜杂种一代利用研究取得突破性进展。此外，甘蓝显性核基因不育系的研究也取得了重要进展，它为中国所特有，已在2001年获得发明专利，并已育成01-216MS等5个具有不同熟性、不同类型的可实用的显性雄性不育系，为甘蓝一代杂种制种开辟了一条新途径；利用这些不育系作母本，已配制出中甘16、17、18、19、21等5个杂交种，经过审定已开始在生产上推广应用（方智远，2002）。大白菜和白菜原产于中国，种质资源十分丰富，经过长期改良，形成了各种不同熟性、不同类型的种类和变种。近20多年来，大白菜已育成一大批具有整齐、抗病、丰产特性的新组合，制种途径主要采用选育自交不亲和系、高代自交系、雄性不育系等。在已育成的200多个组合中，有自交系55个，自交不亲合系212个，雄性不育系21个。雄性不育系的选育，已分别育成雄性不育两用系（单基因雄性不育）、核基因互作雄性不育系、甘蓝型油菜雄性不育系等，这些不育系进一步丰富了亲本的种质资源类型（徐家炳、张风兰，2002）。在白菜的亲本改良上，南京农业大学，上海、广东等省（市）农业科学院主要在当地的优良地方品种中，选育出一批自交系或雄性不育两用系，已配制出一代杂种矮杂系列、矮抗系列、黑叶白菜17号、夏冬青等品种，并广泛在生产上应用。中国辣椒种质资源丰富，类型多样，很有利于种质资源的改良创新。张继仁（1980）从湖南地方品种中筛选出衡阳伏地尖辣椒等7个优良地方品种及道县早泡椒等10个在某一或若干个性状上比较突出的品种。江苏农业科学院蔬菜研究所从地方品种中筛选出如南京黑壳等优良地方品种，进而选育出一批新的亲本材料。中国农业科学院蔬菜花卉研究所引用对TMV和CMV抗性较强的辣椒品种二斧头、灯笼椒、栾川椒与易感病但经济性状好的茄门、同丰37号甜椒作亲本，通过杂交分离、多代回交、抗病性鉴定等方法，筛选出90-109、90-111、90-138、91-126、90-136等系列优良亲本。其他如北京、沈阳、天津市等地有关研究单位也各选育出一批优良亲本材料。进而形成了中椒、湘研、苏椒、甜杂、沈椒、辽椒、哈椒、津椒、海花等在国内生产上颇具影响力的系列优良品种。与辣椒相似，中国黄瓜种质资源也相当丰富，一大批各种类型的地方良种经过育种工作者的改良创新已成为生产上广泛应用的杂交种的重要亲本材料。如天津黄瓜研究所以抗性较好的地方品种天津棒槌瓜和唐山秋瓜为材料，杂交选育出津研系统黄瓜。又如华北刺瓜类型的北京大刺、长春密刺、新泰密刺、宁阳大刺等地方品种及华南类型的安徽小白条、成都二早子、广州青皮吊瓜、广州大青黄瓜等等，对育成现有各种系列的杂交种提供了丰富的种质资源（侯锋，1999）。目前如天津黄瓜所的津绿、津春、津优系列，中国农业科学院蔬菜花卉研究所的中农系列，北京市农林科学院蔬菜研究中心的北京系列和迷你系列，广东省农业科学院的粤秀黄瓜等等均包含了华北、华南类型以及国外温室黄瓜的亲缘关系。

应用国外种质材料经过改良并用于中国蔬菜新品种选育的例子很多，在番茄和辣（甜）椒的新品种选育上更为突出，20世纪70年代由日本引进的番茄品种强力米寿除在生产上直接大面积推广应用外，还被选育成自交系，在中国农业科学院蔬菜花卉研究所育成的中蔬系列番茄品种中作为亲本材料利用。70年代由美国引进的番茄种质材料玛纳佩尔Tm-2v是番茄抗烟草花叶病毒（TMV）的抗源，含抗病基因Tm-2v，该品种表现特别，具有苗期生长缓慢、叶片黄化、开花迟、结果少、果实小等特点。经中国农业科学院蔬菜花卉研究所、江苏、西安、北京等蔬菜科研单位根据育种目标进行转育，已先后选育成如粉果、有限生长、大果等不同类型含抗病基因Tm-2v的材料，并以此为亲本育成了中蔬、中杂、红杂、苏抗、佳粉、佳红、西粉、浦红、浙红、浙粉、东农、渝杂等系列品种。据不完全统计，以上单位所培育出的含Tm-2v基因的一代杂种，每年制种量约逾10万kg，占全国番茄商品用种量的50%左右，累计推广面积约66.7万km，且大大降低了烟草花叶病毒（TMV）在全国的危害程度，改善了市场供应，社会经济效益显著。又如由美国引进的组合力强的Ohio-MR9、含抗叶霉病的系列基因，经过改良转育成抗病材料，并育成了一大批露地和保护地番茄良种。此外，由日本引进的，用英国温室作物研究所筛选出的6个不同基因番茄品种组成的GCR系统番茄，作为番茄上TMV株系的鉴别寄主谱，对摸清中国番茄烟草花叶病毒（TMV）危害情况具重要作用（李树德、冯兰香，1995）。在辣（甜）椒国外优良种质资源的引进上，如中国农业科学院蔬菜花卉研究所从法国引进的优良抗病材料，有抗白粉病的H3、CI、PRIMOR等材料，以及2个抗疫病的商业品种，通过系谱选择法选出了6个优于茄门、对疫病达到抗病和高抗水平的株系，其中4株系兼中抗黄瓜花叶病毒（CMV）和烟草花叶病毒（TMV），对进一步开展甜椒抗疫病育种具有积极作用（张宝玺等，2005）。中国农业科学院蔬菜花卉研究所创新的黄瓜新种质“G5224”，结合了北京小刺、欧洲品种和美国品种的优点，表现全雌性、极早熟、耐低温、高抗角斑病、枯萎病，抗黑星病、白粉病和霜霉病，实现了具有不同血缘的抗病基因源的聚合。新种质“1613”源于欧洲型温室黄瓜与华北型刺瓜杂交选系，该材料表现强雌性、极早熟、耐低温、高抗角斑病、枯萎病，抗黑星病、白粉病和霜霉病。另外，利用具有野生血缘的优良加工抗病品系S452和优良炸片加工品种Atlantic的优点创造出马铃薯新种质“中蔬9408-1”，其炸片颜色为2.5级（美国快餐食品协会标准1～10级，以1级为最优），相对密度（比重）为1.092，平均干物质含量为22.19%，产量比对照品种大西洋增产13.65%。室内接种鉴定，抗马铃薯X病毒，高抗马铃薯Y病毒；田间鉴定抗马铃薯晚疫病。这将在改变国内马铃薯市场加工品种为国外品种所独占的局面中发挥重要作用。上述研究结果表明，通过常规杂交、分离、回交、选择等方法进行蔬菜种质资源的改良创新仍是目前采用的主要方法，而且效果显著。

除采用上述方法外，近年还利用花药和游离小孢子培养技术，选育优良的亲本材料。花药和花粉培养是快速获得优良纯系的有效方法，与常规多代自交获得纯系相比，具有周期短、效率高、纯系稳定等特点。而游离小孢子培养还具有花药培养所不具备的单细胞单倍体、群体数量多、自然分散性好、不受体细胞干扰、便于遗传操作等优点，而且能够快速获得双单倍体高纯度材料。河南省生物技术研究所在近10多年的时间里采用该项技术成功地培育、繁殖了大白菜品种8个，推广面积20万km。这是小孢子培养技术在蔬菜种质资源创新和遗传育种上的成功例子。此外，在芸薹属植物中先后对油菜、芥菜、大白菜的、白菜、甘蓝和芜菁等进行了游离小孢子培养，并获得了再生植株（蒋武生等，2002）。北京市海淀区植物组织培养技术实验室利用从日本引进的平安荣光品种，经花药培养和选育，1982年育成了中国首个花培甜椒品种海花3号；利用保加利亚辣椒经花培育成了海花1号辣椒，并进一步育成用花培品系作亲本的海丰系列杂交种10余个，在生产上大面积推广。此外，张家口市蔬菜研究所经多年研究也育成了以塞花命名的花培品种，并在生产上推广应用（邹学校、蒋钟仁，2002）。游离小孢子培养和花药培养技术，在细胞水平上为蔬菜种质资源的改良、创新和遗传育种开拓了一条新的途径。

近年，原生质体培养和体细胞杂交技术也已用于蔬菜种质资源的改良与创新研究。胡萝卜原生质体融合在7个融合组合中获得再生植株，在1个融合组合中成功地实现了胡萝卜瓣花性雄性不育性的转育。原生质体融合获得6个优良茄子品种与两个茄子野生远缘种的体细胞杂种植株，并将野生茄子中的抗病基因转到普通茄子中（李锡香等，2006）。

此外，植物基因工程在蔬菜种质的改良与创新方面也取得了一些新进展，例如在控制蔬菜果实成熟基因的利用上取得了成功。叶志彪等利用番茄乙烯形成酶（EFE）cDNA克隆，构建反义载体，通过农杆菌Ti质粒介导，转化子叶外植体，感染的外植体与农杆菌共培养，再生出完整的番茄植株。经检测，导入的标记基因能在后代中遗传传递。所获得两个转基因株系的EFE活性和乙烯的生成均受到明显的抑制，不及对照的10%。贮藏试验表明，转基因植株果实的好果率在贮藏88～92d后仍在80%以上，比对照贮藏期延长8～10倍，而其他特性与原亲本相似（叶志彪等，1995）。

10、怎样进行甘蔗种质创新？

甘蔗种质创新主要通过有性杂交或基因工程技术向甘蔗导入野生种质或外源基因来达到创制新种质的目的。种质创新包括材料创新和方法创新两个方面。甘蔗种质杂交创新主要包括：①高产、高糖的高贵种受体亲本同抗逆性强的野生种之间的基础性杂交，产生具有优良特异材料或育种中间材料；②通过适当的遗传交配设计，从优良中间材料的高度变异的F群体中，应用配合力和遗传力分析，评价出具有商业利用价值的商品性杂交，从而产生优良亲本材料或育种中间材料；③利用基因工程技术把外源目的基因应用基因枪或农杆菌两种渠道转化某些甘蔗良种，使之表达外源目的基因特性的转基因甘蔗。