種質創新

1、菜薹種質資源創新有哪些方面？

一、傳統方法在菜薹種質創新中的應用

現有菜薹種質資源主要來源於常規途徑，常規技術中應用最多的方法是系統選育法，即根據育種目標對原始材料中的不同株系進行多次選擇、比較鑒定，篩選出優良的種質。利用這種方法，廣東省廣州市蔬菜科學研究所選育出四九心-19號，四九心-20號，其中四九心-19號產量比四九心增產1950～3900kg/ km2，葉色較深綠，主薹高度增加6～8cm，除耐熱、耐濕外，還較耐霜霉病和菌核病，是目前菜薹常規品種中種植面積最大的早熟品種之一。十月紅菜薹則是由胭脂紅中發現的優良單株經過系譜選育而得，曾是湖北省的主栽品種，且被推廣到長江流域各省。

華南農業大學植保系篩選出抗病毒病品種60天特青，然後對60天特青經單株選擇的20多個不同株系進行田間比較，選出代號為8722的中花菜心品種，後來又對8722菜心進行優質、豐產、耐病毒病的系統選育，篩選出8722選菜心新品種。

油綠50天菜心則是利用四九菜心與50天菜心雜交選育的151菜心為母本，以60天菜心為父本，雜交後經過連續8代自交選育而成（張華等，2005）。

張華等（2005）於1999年利用遲心2號與60天油青菜心雜交，經連續6代自交系選出葉薹油綠、商品性較理想的油綠701品種。

雄性不育是高等植物中普遍存在的一種現象，十字花科芸薹屬作物雜種優勢明顯，採用雄性不育系制種是此屬作物利用雜種優勢的主要途徑之一。回交轉育是獲得優良雄性不育系的最常用的方法。李大忠（2002）從福州市地方菜薹品種七葉心自交後代中發現不育株。經過一代測交，三代回交後，不育株率穩定在50%左右，獲得雄性不育兩用系66A。用66A與小白菜雜交，雜種一代的一般性狀偏向小白菜，表現出較強的生長優勢，尤其是可食用部分較父母本增長了1～2倍；品質卻偏向菜薹，略帶甜味，柔軟可口。趙利民等（2005）以大白菜CM S341127為不育胞質供體，以柳州早菜薹為受體，通過雜交、連續回交方法育成菜薹胞質雄性不育系TC12321。TC12321植株生長發育正常，不育性穩定，雌蕊功能正常，蜜腺發育健全，自然授粉結實良好，經濟性狀優良，配合力高，綜合抗病性強。許明等（2003）利用大白菜核不育系9810721 作為不育源，以紫菜薹ZB3 為目標親本，經過雜交、自交、兄妹交等轉育手段，將雄性不育基因轉育到紫菜薹中，獲得紫菜薹「甲型」兩用系、臨時保持系和雄性不育系。而且筆者採用同樣的方法，將核不育基因向菜薹品種轉育，得到了含有早-49遺傳基因的新甲型兩用系、臨時保持系和雄性不育系（許明等，2006）。王玉剛等（2005）亦通過雜交、自交等方法，將白菜雄性核不育性向菜薹可育品系03S001（翡翠油青菜心）中轉育，獲得了新的菜薹100 %核不育系及其相應的甲型兩用系和臨時保持系。

二、遠緣雜交在菜薹種質創新中的應用

菜薹和油菜的AA組染色體相同，且其種間雜交有低度育性，為將油菜雄性不育基因轉育到菜薹上提供了條件。劉勝洪等（2006）的試驗表明：雜交後代的花葯不育率為F1代＜BC1代＜BC3代，在BC3代群體植株中，不育率為94.60%，接近BC2代植株不育率水平，說明在不斷的回交過程中，植株的不育率越來越高並相對穩定。

晏儒來、向長萍等（2000）於1988年開始向紫菜薹轉育波里馬油菜雄性不育系，以甘藍型油菜和紫菜薹的雜種作母本，最初用大股子作轉育親本，經過4年6代的轉育選擇，於1992年秋從240個測交種中獲得不育率達100%且性狀相對穩定的材料3 份，即0-1、0-2-2、28-9 及其相應的保持系5 -1-4、5-1-3 和29-4-2。為了改良上述不育系的綜合性狀，1995年以抗病、早熟、耐熱和菜薹無苦味為主要改良目標性狀，選用了OF 系統（十月紅2號×四九菜心）的一些早熟株系和十月紅2號的一些株系為轉育親本。選用9405的F2 中19個不育株作母本雜交，在後代中堅持選不育率高的測交種，再從中選不育性徹底，生長勢較強，早、中熟，抗病性強，且無苦味的不育株。經過3年6 代的選擇，於1997年秋育成不育率達100%且綜合性狀較好的不育系9617、9630、9631 及其相應的保持系。其中9617 自播種至開始採收為40～45d，9630 為50d，9631 為55d左右。

劉自珠（1996）利用甘藍型油菜雄性不育株為不育源、菜薹為轉育父本，通過種間雜交、連續回交，選育出菜薹胞質雄性不育系002-8-20A及相應的保持系049-20B。該不育系結實正常，不育株率和不育度達到93%以上，已用於雜種一代組合的配製。

張成合等（2003）將菜薹同源三倍體與二倍體相互雜交，3x×2x的結籽率為34.78%，2x×3x的結籽率為26.17%。經染色體檢查，雜交子代植株絕大多數為非整倍體，其中三體植株佔33.3%（3x×2x）和40.70%（2x×3x）。經細胞學鑒定和核型分析，從三體植株中初步鑒定出三體3、三體7、三體8和三體9 等4 種初級三體。這些都是難得的遺傳材料。

黃邦全等（1999）通過種間雜交將Ogura 蘿卜雄性不育細胞質導入了紫菜薹，通過連續回交獲得了葉色正常、蜜腺正常的紫菜薹Ogura細胞質雄性不育系。黃邦全（2002）以Ogura細胞質雄性不育紫菜薹（AA，2n=20）為母本，以不同蘿卜品種（RR，2n=18）為父本進行雜交，獲得了大量的屬間雜種。雜種F1幼苗在低溫下子葉及真葉均不缺綠，以紅蘿卜為父本獲得的雜種F1植株葉柄、葉脈呈紫紅色；以白蘿卜為父本獲得的雜種F1植株葉柄和葉脈不呈紫紅色。所有的雜種F1植株都開白花，蜜腺正常。雄配子高度不育，但是雌配子具有部分育性。雜種F1花粉母細胞的染色體數目為預期的2n=19，染色體平均配對構型為15.53Ⅰ＋1.34Ⅱ＋0.25Ⅲ＋0.01Ⅳ，多數染色體以單價體的形式存在，但也有一些二價體、三價體甚至四價體，最多達到6Ⅰ＋3Ⅱ＋1Ⅳ，參加配對的染色體數達13條，表明A染色體組和R染色體組具有一定的同源性，蘿卜染色體上的有利基因可以通過部分同源重組或者代換進入到紫菜薹中。同時，在F1中發現了2株染色體自然加倍的雙二倍體。雙二倍體與未加倍的雜種F1都表現為父本蘿卜的白花性狀，蜜腺正常，低溫下子葉不黃化。雖然雙二倍體在減數分裂過程中能形成具有19條染色體的配子，雙二倍體的花葯比未加倍的雜種F1發育要好得多，但是雙二倍體的育性還是低於未加倍的雜種F1。盡管未加倍的雜種F1在減數分裂時多數染色體以單價體的形式存在，同時也有二價體、三價體甚至四價體的形成，並且存在落後染色體和染色體橋。

黃邦全（2002）以OguraCMS紫菜薹×蘿卜雜種F1（AR，2n=19）為母本，以甘藍型油菜（AACC，2n=38）為父本進行雜交，獲得了8 株雜種植株。其中1株（PRN-1）的花色為嵌合體，該植株上的花多為黃色，但是也有乳白色花，另外還有1朵花甚至1個花瓣上同時具有黃色和白色區域，其餘3株（PRN-2、PRN-3、PRN-4）都開白花。PRN-4的花葯開花前退化，其餘3株都可以看到3～6枚花葯，能夠產生部分花粉，但是PRN-2的花粉不能被I2-KI溶液染色。PRN-2具有4個蜜腺，PRN-1和PRN-3具有2個蜜腺，PRN-4無可見蜜腺。在低溫下，PRN-2葉色正常，其餘3株幼葉表現不同程度缺綠。PRN-1的染色體數目為2n=38，PNR-2的染色體數目為2n=35，PRN-3的染色體數目為33，PRN-4的染色體數目未能確定。它們的染色體平均配對構型各不相同。與甘藍型油菜回交後，PRN-1、PRN-2、PRN-3 植株各自產生了一定數量的種子，而PRN-4則未產生種子。

梁紅等（1994）用雜種胚離體培養的方法獲得了菜薹與甘藍的正反交F1代。雜種一代的一般性狀介於兩親本之間，偏向父本，並表現出強烈的生長優勢。其蛋白質含量普遍超親，游離氨基酸含量和還原糖含量介於兩親本之間，或超過高親親本。

鄭岩松等（2003）研究了芥藍以及芥藍×菜薹種間雜種後代對蕪菁花葉病毒（TuMV）油菜株系的抗性。結果表明，芥藍對廣東省廣州地區TuMV油菜株系具有近於免疫的抗性。芥藍×菜薹種間雜種回交後代抗TuMV油菜株系的選擇效應受回交親本影響很大：用抗病品種與雜種回交的後代，經兩次系統選擇後，已獲得16個經濟性狀較好的抗病品系；但用感病品種與雜種回交兩代之後，抗病性明顯下降。

三、物理化學誘變在菜薹種質創新中的應用

誘變育種是利用理化因素誘發植物發生變異，通過選擇育成新品種的方法。

尚愛芹等（1999）利用不同濃度的秋水仙素對二倍體菜薹種子和幼苗生長點進行不同時間長度的浸泡，結果表明，用0.1%秋水仙素水溶液處理幼苗生長點48h的誘變效果最好，誘變率可達26.67%，浸泡種子效果不佳，最高誘變率僅為4.0%。四倍體植株結籽率較二倍體明顯降低，平均達42.3%，而八倍體植株幾乎是完全不育的。隨著染色體組的增加，花粉粒大小和葉片保衛細胞中的葉綠體數均顯著增加，與二倍體（CK）比較，四倍體植株生長旺盛，花薹的產量和品質均有所提高。

廖飛雄等（2001）利用60Co-γ射線輻射菜薹種子，發現對預先浸泡1h的菜薹種子來說，適宜的處理劑量為200～300Gy。廖飛雄等（2003）對60Co-γ射線輻射後的菜薹器官進行離體培養時，發現對菜薹種子的適宜輻射劑量是200Gy左右，經過催芽的種子適宜劑量為50～100Gy，離體培養莖尖可用40～70Gy。

四、生物技術在菜薹種質創新中的應用

（一）體細胞變異體離體篩選

組織培養得到的再生植株以一定頻率發生變異是一種普遍的現象，這便是利用植物體細胞變異體離體選擇法對作物現有品種進行有限的修飾與改良的基礎。通過這種方法，已成功地篩選出耐鹽水稻、抗稻瘟病細胞突變體、抗除草劑大豆等一系列有價值的突變體，在作物遺傳改良方面發揮了重要作用。在植物耐熱性篩選研究中與傳統的耐熱性選擇方法相比，離體篩選方法具有不受季節和氣候條件限制、變異范圍廣、選擇群體大、節省土地和人力等特點，可顯著提高種質資源創新的效率。

何曉明等（1999）進行了菜薹耐熱性離體篩選的研究，結果表明，耐熱性不同的菜薹品種對離體培養中的熱脅迫反應亦有所差異，35℃培養30d的無菌苗存活率可以作為菜薹耐熱離體篩選的選擇指標。通過熱脅迫交替選擇，從熱敏菜薹品種中，初步篩選出3個耐熱無性系A -2、B -1、B -8。這些無性系耐熱品系在熱脅迫中的莖尖存活率基本保持在60%～80%，而未經篩選的無性系莖尖的存活率平均僅為20. 83%，因此經過篩選的無性系的耐熱性有了明顯改善。同時還發現，經9 代培養和4次熱脅迫篩選，這3個無性系的耐熱性均表現比較穩定，表明這種耐熱性可以在無性繁殖過程中傳遞下去。通過熱脅迫選出的無性系其莖尖繁殖系數也較原群體有所提高。

廖飛雄等（2003）在離體篩選耐羥脯氨酸變異的研究中，發現對菜薹莖尖和愈傷組織來說，經0.3mg/ml的羥脯氨酸3～4個周期篩選後，可獲穩定抗性株系。菜薹種子萌發後的幼苗在1.0mg/ml濃度上，經4個世代連續篩選可獲抗性株系。3mg/ml濃度可用於幼苗的前期淘汰。入選系耐羥脯氨酸的能力和耐熱性提高。廖飛雄等（2004）利用「六十天特青，離體篩選出的一個菜薹耐羥脯氨酸選擇系Hypr01，發現在人工氣候箱模擬栽培高溫逆境下，Hypr01和未經選擇的六十天特青相比，有較強的耐熱性。

（二）基因工程

徐秉芳等（1996）研究報道紫菜薹的花粉經低溫水合、熱激、滲激三步程序，分離出大量具萌發能力的脫外壁花粉，脫外壁率可高達60%以上。在含有碳源與氮源及Roberts 培養基鹽成分的鹼性PEG培養基中，首次使芸薹屬脫外壁花粉萌發，萌發率可達41%。這使得利用花粉作為外源基因的媒介進行植物遺傳的轉化有了重要的突破。

施華中（1995）以花粉特異啟動子Zm13-260 控制的Gus 基因作為報告基因，用電激法分別轉化紫菜薹花粉原生質體和花粉粒，通過瞬間表達檢測，比較了二者的轉化效果。結果表明，花粉原生質體的電激導入效果比花粉粒高，前者的Gus 基因瞬間表達水平遠遠高於後者，Gus 基因活性是後者的10倍。並探討了Gus 基因在不同發育時期花粉原生質體中的時序表達特性，花粉愈幼嫩，Zm13 的啟動活性愈低。

張國裕等（2006）以建立的菜薹高頻再生體系為基礎，利用GUS染色組織分析法研究了根癌農桿菌菌株、乙醯丁香酮（A S）、預培養時間、浸染時間和共培養時間等因素對菜薹（B rassica camp estris L. var. pchinesis）子葉遺傳轉化的影響，探討了適宜菜薹轉化的卡那黴素與抑菌抗生素使用濃度。結果表明，農桿菌菌株A GL0 對菜薹的浸染能力最強，添加乙醯丁香酮有利於菜薹轉化；子葉外植體預培養2d 後浸染（菌液濃度OD 600值為0.8）15min，共培養2d，然後轉移到含15mg/L 卡那黴素和100mg/L T icarcillin 的篩選培養基上，進行轉化植株的再生，植株再生率及外植體GUS 陽性率均較高，是較優的轉化條件；該試驗共獲得8 株轉化植株，轉化率達2.44%，經PCR分析和Southern 雜交檢測表明，Gus基因已整合進入菜薹基因組。

張揚勇等（2003）通過對農桿菌介導法將韌皮部特異表達啟動子RSs-1（Rice sucrose synthase-1，水稻蔗糖合成酶）與雪花蓮凝集素（Galanthus nivalid agglutinin，GNA）基因構成的嵌合基因轉化菜薹，獲得轉基因植株。該試驗目的是利用雪花蓮凝集素對刺吸式昆蟲有較好的抗蟲效果，採用延遲篩選抗生芽的方式，最終得到了抗生植株，並通過了分子檢測。

通過基因工程的手段進行菜薹種質的創新還剛剛起步，隨著菜薹轉基因體系的逐步完善以及克隆的有用基因越來越多，該技術在菜薹種質改良中的應用將越來越廣泛。

2、苦瓜種質資源的創新有什麼作用？

種質創新泛指人們利用各種變異（自然發生的或人工創造的），通過人工選擇的方法，根據不同目的而創造的新種、新類型、新材料。種質創新是遺傳多樣性拓展的重要途徑，是種質資源有效利用的前提和關鍵，是作物遺傳育種發展的基礎和保證。目前，苦瓜種質資源的創新成效主要表現在經選育的地方品種的直接利用，以及以通過雜交育種等手段創造的優良新種質作為親本材料，配製培育新的一代雜種。

在一代雜種沒有大面積推廣之前，中國各地的苦瓜主栽品種基本上是常規品種，因此在生產中占據著重要地位。這些常規種都是在當地地方品種或引進其他地區地方品種的基礎上，經系統選育或雜交選育的優良品種。如藍山大白苦瓜是湖南省藍山縣蔬菜研究所科技人員用藍山鱔魚苦瓜與藍山鯉魚婆苦瓜進行雜交，再從雜交後代中經連續8年系統選育而成。該品種早熟、耐熱、喜濕、喜肥、抗病蟲力強，品質極佳，肉質細嫩、柔軟，是目前全國主要的優良苦瓜品種之一，已在全國30個省（直轄市、自治區）試種成功，並受到廣大農民和消費者的歡迎。

近十多年來，中國從優良地方品種的利用逐步轉向了栽培品種的雜優化選育。為了適應市場和生產的需要，各地先後育成了一批不同類型的新品種，實現了適合於不同季節、不同栽培方式（露地和保護地）、不同成熟期（早、中、晚熟栽培）以及適合於鮮食和加工等不同用途的專用品種，從而促進了苦瓜生產的發展。

在鑒定、評價的基礎上，篩選、純化種質資源以獲得優良的自交系是配製雜交組合的基礎。在相繼被選育出的一批綜合性狀優良的苦瓜一代雜種中，許多都是以系統選育的優良苦瓜地方品種作為親本。例如，湖南省蔬菜研究所選育的早中熟、高產、耐熱、抗病、優質的一代雜種湘苦瓜2號，其母本是從揚子洲白苦瓜中選育的自交系，父本是從株洲長白苦瓜中選育的自交系。湖南省衡陽市蔬菜研究所選育的中早熟，主蔓雌花率高，瓜色油綠、有光澤，高抗病毒病、枯萎病、中抗霜霉病的一代雜種衡雜苦瓜2號，其母本B06是從廣東省一個地方品種用雙株選擇法經5代自交分離選育的自交系，父本B02-5是從湖南省地方品種藍山苦瓜的變異株經5代自交定向選育而成的優良自交系（肖昌華，2005）。湖南省農業科學院蔬菜研究所選育的春燕苦瓜表現為極早熟，瓜棒形，皮色翠綠，味稍苦，商品性好，早期產量高。其母本是從廣東省地方品種江門大頂苦瓜中發現的一個突變株，經7代自交分離，定向選育的自交系。父本是從貴州地方品種獨山青皮苦瓜經5代自交定向選育而成的自交系（粟建文，2005）。大肉2號苦瓜是廣西自治區農業科學院蔬菜研究中心培育的一代雜種，中熟偏早，產量高，瓜長圓筒形，皮色淺綠，光滑油亮，大直瘤，肉質甘脆，品質佳，較耐白粉病。其母本C10-26是由泰國曼谷苦瓜經7代自交分離選育的優良自交系，父本S5是從廣西自治區地方品種蘇圩苦瓜經5代自交分離選育的自交系（方鋒學，2003）。

豐富的種質資源是種質創新的物質基礎。苦瓜以其特殊的營養成分和葯理作用決定了其潛在的應用價值。盡管目前苦瓜種質資源的創新利用水平還較低，然而隨著日新月異的分子生物學技術和現代生物技術的發展，以豐富的苦瓜種質資源及其野生近緣種為材料，在篩選、鑒定、評價的基礎上，深入地開展苦瓜優異種質資源創新及優異基因挖掘等研究，不僅將大大提升苦瓜種質資源研究水平，而且也將為苦瓜育種和生產的可持續發展奠定堅實的基礎。

3、黃瓜種質資源創新有哪些？

（一）通過遠緣雜交創新種質

黃瓜（Cucumis sativus L.）與甜瓜（C.melo L.）的種間雜交長期以來很受人們重視，因為甜瓜具有黃瓜所缺乏的對某些病原體的抗性。如果雜交成功，將極大地豐富黃瓜的基因。但在栽培黃瓜與甜瓜及其野生種之間的雜交很難成功。Ondrej等報道（2001），由於受精後的障礙，栽培甜瓜和黃瓜正反交雜種的胚只能發育到球形胚階段。由於體細胞的不親和性，甜瓜×黃瓜的體細胞雜種細胞在愈傷組織階段就停止了分裂（Jarl et al.，1995）。迄今為止，國內外研究者對黃瓜屬兩個栽培作物之間的種間雜交還未取得成功。關於黃瓜屬栽培作物與野生種之間的種間雜交，大多數的雜交只進行到胚這一階段。除了Chen等（1997，1998）的報道外，其他關於獲得種間可育F1的報道都難以重復。

Chen等（1997）首次報道了採用胚胎拯救方法，利用野甜瓜（Cucumis hystrix Chakr.）（2n=2x=24）與栽培種黃瓜進行種間雜交獲得成功，且得到了不育的後代（2n=19）。為了恢復育性，在正反交的基礎上，應用體細胞無性系變異（somaclonal variation）通過進行染色體加倍，經過育性恢復篩選，獲得了一種有商業開發前景的甜瓜屬雙二倍體新種質（Chen et al.，1998）。新種質被定名為Cucumis hytivus（Chen and Kirkbride，2000），其基因組為HHCC（H和C分別代表C.hystrix和C.sativus的基因組），染色體數為2n=4x=38。新種質在露地和溫室都表現出旺盛的結果能力，每株可結果30個左右，常常2～3個果結在同一節上，果型整齊，可一次採收，適用於腌制類型黃瓜品種的選育。果實細長，基本無種子，果重約50～100g，果長約10cm，果型指數3.3；嫩果綠色，除黃瓜味外還稍有檸檬味，蛋白質和礦物質的含量分別為0.78%和0.35%，均分別高於普通黃瓜含量0.62%和0.27%。同時，新種質抗白粉病，對南方根結線蟲的抗性介於野生種酸黃瓜和栽培黃瓜之間，當雜種作為供體親本與栽培黃瓜進行回交時，抗性被進一步轉移到回交一代中（陳勁楓等，2001）。新物種的光補償點為11.25μE/（m2s），低於以往報道的耐弱光品種長春密刺。弱光處理2周後，新種的葉綠素a和葉綠素b含量增加，葉綠素a/b的值大幅度降低，形態學耐弱光隸屬值高達0.946，說明雜交新種耐弱光能力很強（錢春桃等，2002）。

表15-5 甜瓜屬栽培種和野生種的種間雜交

陳勁楓等（2003）將種間雜交獲得的異源三倍體與栽培黃瓜北京截頭雜交，經過胚挽救獲得了兩個2n=15（14C+1H）的單體附加系02-17和02-39。前者植株葉形為掌狀形，後者為深陷的掌狀形，並且果實均為白色，不同於異源單倍體的掌狀心臟形和黑刺，果形比異源三倍體黃瓜更長接近普通黃瓜。細胞學和RAPD分析發現，上述附加系附加了野生種Cucumis hystris的染色體。

（二）通過種內雜交創新種質

黃瓜屬變種間的基因交流比種間容易得多。黃瓜的野生變種與普通栽培種相互雜交可育，因此，多年來國內外育種家一直致力將野生變種中的分枝性強、結果數多、高抗某些病蟲害等優良基因轉移到栽培品種中。

Deakin等（1971），Staub和Kupper（1985a）都曾採用野生黃瓜（C.sativus var.hardwickii）與栽培黃瓜雜交的方式創造新的種質。野生黃瓜的一個株系LJ90430比栽培黃瓜植株大，側枝多，種子小，具短日照習性，在北加州秋季氣候條件下，LJ90430株系通常每株能產約80個成熟果實（Horst and Lower，1978）。該株系被廣泛運用在育種計劃中，並且先後獲得了一系列具有改良性狀的優異種質（Staub，1985b，1992；Peterson，1986）。

Walters等（1997）利用野生資源LJ90430與栽培種質雜交、回交和自交，創新出了抗北方根結線蟲和爪窪根結線蟲的系列種質NC42～NC46。

Simon 等（1997）以美國種質SMR18為母本，西雙版納黃瓜為父本，進行回交，選擇果肉顏色深的半姐妹系，通過3代的姐妹交和混合選擇，獲得後代材料104，後繼續姐妹交和選擇，獲得了新種質LOM 404，其胡蘿卜素含量最高可達15mg/kg。以美國種質Addis為母本，西雙版納黃瓜為父本，進行回交，通過3代的姐妹交和混合選擇，獲得後代材料101，用104與101雜交後，經連續五代自交單株選擇和一代混合選擇獲得新種質EOM 400和EOM 402；其胡蘿卜素含量高達25mg/kg（圖15-10、15-11）。

圖15-10 高胡蘿卜素黃瓜種質的創新

圖15-11 高胡蘿卜素黃瓜種質LOM 404的4個成熟果實的縱切面

國內外黃瓜育種家，利用對各自掌握的種質資源，通過類型或品種間雜交，育成了大批抗病、抗逆、優質、高產、熟性各異的自交系和雌性系，促進了黃瓜品種的雜優化。例如，卓齊勇等（1988）於1975年從引進的早龍和黑龍第二代植株中發現全雌株、強雌株和普通株3種類型。早代利用強雌株的雄花授予全雌株的雌花上，晚世代結合赤黴素誘雄和自花授粉，選育出全雌株率達到94.4%～100%的雌性系奧早和黑龍選。之後，利用回交轉育的方法，以奧早和全青為親本，以優質抗霜霉病的全青為輪回親本，連續回交3～4次獲得全青的優良性狀，然後在經過2～3代自交，獲得一系列雌株率在90%以上的優良雌性和強雌性株系，其中奧早75和奧早82為優質、早熟、抗病的雌性系。1995年，卓齊勇等又用82雌性系作母本，大悟大吊瓜作回交親本，進行雜交並回交一次，經過7代的抗病性篩選，選育出抗疫病、霜霉病、炭疽病、細菌性角斑病等5種病害的82大雌性系。尹彥、李錫香等利用國內外不同類型的黃瓜種質通過雜交、添加雜交和系統選育創新出全雌性和復雌性黃瓜新種質G5224和EF1613。G5224是由國外品種Branex（F1）的自交分離群體所選單株與北京刺瓜的自交系（S5）雜交，經多代系統選擇得到優良自交系後，又與引自美國的5207雜交，再經多代系統選擇而育成。該自交系結合了北京小刺、歐洲品種和美國品種的優點，表現全雌性、早熟、坐果率較高，果實商品性好，瓜長30cm左右，瘤刺大小和稀密中等，瓜色深綠，有光澤，無黃色條紋，心室較小。植株耐低溫，苗期在10℃和3000lx光照條件下處理15d後幼苗成活率為92.2%，比對照新泰密刺高16.4%，抗角斑病、枯萎病、黑星病、白粉病，耐霜霉病和灰霉病。EF1613是以編號為 373/85的國外黃瓜品種與北京刺瓜雜交，經4代純化選擇，得到優良株系後，又與來自東北地區的一個地方品種8970雜交，經過多代選擇，最終形成EF 1613品系。該品系長勢強健，雌花多，坐果率較高，以主蔓結瓜為主，側蔓數量不多，果實商品性好，瓜長30cm左右，瘤刺大小和稀密中等，瓜色深綠，有光澤，無黃色條紋，心室較小。植株高抗黑星病，抗角斑病、枯萎病、白粉病，中抗根結線蟲，耐霜霉病。利用上述優異種質，培育出雌性和強雌性黃瓜雜交一代系列中農202、中農203、中農208等。

利用常規方法進行種質改良的研究較多，在此不再贅述。

誘變育種就是利用物理因素（如X射線、γ射線、紫外線、激光等）或化學因素（亞硝酸、硫酸二乙酯等）來處理生物，使生物發生基因突變。從而在短時間內獲得更多的優良變異類型的育種方法。

陳勁楓等（2004）利用0.4%的秋水仙鹼浸萌動的黃瓜種子，染色體加倍率可達26.7%。與原二倍體相比，同源四倍體的側枝數減少，葉柄變短，葉面積增大，花器變大，果型指數減小。四倍體花粉的可染率和萌發率均顯著降低。

雷春等（2004）通過輻射劑量為200 Gy或300 Gy的C射線輻射花粉授粉並結合胚培養，從3個基因型黃瓜中獲得了單倍體植株。與正常二倍體植株相比，單倍體植株生長緩慢，花器異常。研究同時發現輻射劑量、親本基因型、授粉組合對坐果率和單倍體產率有一定影響。

圖15-12 黃瓜自交系CHA03210搭載前後植株葉片變異

1.CHA03210搭載前後葉片大小 2.CHA03210搭載後部分自封頂（引自余紀柱等，2007）

李加旺等（1997）利用23.22C／kg60Co γ射線輻射處理具有某些優良特性的黃瓜自交系種子，並在其變異後代群體中，篩選出兩個綜合性狀優良的單株。經3代系選，從中分選出一個主要性狀均能穩定遺傳的株系輻M-8。該株系集幾種優異性狀於一體，用其為親本與另一高代自交系配製出適於日光溫室栽培的耐低溫、弱光雜交一代組合：93-黃瓜新品系。

圖15-13 黃瓜自交系CHA03210搭載後變異株自交後代果實的變異

陳勁楓等（2004）在室溫條件下，用0.2%、0.4%、0.8%的秋水仙素水溶液分別處理黃瓜津綠4號干種子和萌動種子。結果表明，0.4%的秋水仙素浸萌動種子4h的染色體加倍效果最好，加倍率可達26.7%。與原二倍體相比，同源四倍體的側枝數減少，葉柄變短，葉面積增大，花器變大，果型指數減小。四倍體花粉粒大小不一，每一朵花中平均有2.3%的4孔花粉粒；四倍體花粉的可染率和萌發率均顯著降低。

航天誘變是誘變的一種特殊形式，是利用衛星或高空氣球攜帶、搭載植物種子等生物體樣品，經特殊的空間環境條件（強宇宙射線、高真空、微重力等）作用，引起生物體的染色體畸變，進而誘發生物體遺傳變異，經地面種植選育試驗後，能快速而有效地育成作物的新品種（系），供生產上推廣利用，可廣泛應用於各種植物的遺傳改進。這種技術也為黃瓜種質創新開辟了新途徑。余紀柱等（2007）利用衛星搭載黃瓜自交系材料，通過地面種植、觀察，當代植株即發生了葉片大小和株型自封頂變異，經過自交分離，後代果實大小、果形指數、雌花節率和每節雌花數發生較大變異，經純化獲得特小型黃瓜自交系CHA03-10-2-2。該自交系瓜長8cm左右，雌花節率達99.5%，表現穩定，可直接用於培育特小型黃瓜新品種。

（四）利用細胞工程和基因工程創新種質

細胞工程是應用細胞生物學和分子生物學方法，藉助工程學的試驗方法或技術，在細胞水平上研究改造生物遺傳特性和生物學特性，以獲得特定的細胞、細胞產品或新生物體的有關理論和技術方法的學科。廣義的細胞工程包括所有的生物組織、器官及細胞離體操作和培養技術，狹義的細胞工程則是指細胞融合和細胞培養技術。植物細胞工程包括：植物組織、器官培養技術，細胞培養技術，原生質體融合與培養技術，亞細胞水平的操作技術等。目前，細胞工程技術在黃瓜種質創新中的應用主要集中在大孢子培養、原生質體培養和體細胞融合等方面。

據杜勝利（2004）介紹，天津科潤黃瓜研究所「利用分子標記和單倍體技術創造黃瓜育種新材料研究」項目通過了天津市科委組織的技術鑒定。該項目通過對黃瓜雌核發育機制研究、黃瓜離體雌核發育培養體系、黃瓜染色體倍性鑒定及加倍技術研究，建立了一套高效、穩定的黃瓜未受精子房培養的技術體系，再生頻率達25%。研究和建立了一套簡單、快速而有效的倍性鑒定方法，篩選出誘導黃瓜單倍體、雙單倍體染色體加倍的有效辦法，加倍頻率達16.9%。據孫日飛（2005）的進一步介紹，黃瓜大孢子培養以開花前2～3d為接種的最佳時期，以Miller為基本培養基，以AD或ADS為細胞分裂素，以蔗糖為首選糖源。無菌材料經橫切或縱切後，接種至誘導培養基三角瓶中，後轉至培養室培養：並以25℃黑暗條件培養7d，然後移至等溫度14h/10h（光照/黑暗）條件下培養為最好。該技術已基本成熟，並已以此培育出了植株。

黃瓜由子葉、真葉和胚性懸浮培養細胞等材料的原生質體培養已成功（呂德揚等，1984；劉少翔等，1991，賈士榮等，1985，1988；Punja等，1990），但是再生植株相對困難。

為了獲得再生植株，張興國等（1998a）對黃瓜原生質體分離和再生條件的研究表明，7日齡初展黃瓜子葉和15～17d的真葉，在1%纖維素酶、0.5%離析酶和0.25～0.30mol／L甘露醇混合酶液中，均分離出大量原生質體，轉入附加1mg／L BA和0.5mg／L 2，4-D的改良KM培養基（去除NH4NO3）中淺層液體培養，形成微愈傷組織。由成都二早子黃瓜真葉原生質體愈傷組織培養的胚狀體和子葉原生質體愈傷組織誘導的不定芽，都培育出了小植株。

張興國等（1998b）將黃瓜子葉原生質體來源的愈傷組織在1.0mg／L BA和0.05mg／L NAA的MS固體培養基上再生綠苗，經生根成為完整植株。10μg／ml諾丹明6G（R6G）處理15min或1.5mmol／L碘乙酸（IOA）處理10min，均能有效地抑制黃瓜原生質體分裂。分別經R6G和IOA生理性失活的原生質體經PEG和高鈣高pH法融合後可恢復分裂生長。由4個黃瓜種內組合得到了愈傷組織。部分愈傷組織分化了根，部分愈傷組織經酯酶同功酶分析確定為體細胞雜種。

基因工程技術在黃瓜種質創新中的應用也有了一些進展。國內報道了採用介導外源DNA的方法改良黃瓜種質的試驗。鄧立平等（1995）曾報道以抗霜霉病津研4號黃瓜為供體，豐產感病黃瓜長春密刺為受體，於人工輔助授粉後12～24h，採用微注射法通過柱頭將外源DNA注入受體子房，從而導入了外源基因，獲得了穩定的突變新品系CJ90-40。

鄒長文（2004）將冷誘導基因cor15a基因和轉錄因子CBF3基因同時導入黃瓜基因組，並通過了植物基因組DNA的PCR檢測和Southern雜交檢測。PCR檢測結果表明有4株植株攜有cor15a基因，有3株植株攜有CBF3基因，其中只有2株攜有雙基因。轉基因植株的Southern雜交結果證明兩株攜有雙表達盒的轉基因植株中，其中1株的目的基因拷貝數為2，另一株為1個拷貝，證明目的基因已經導入黃瓜基因組中。

4、瓠瓜的種質資源創新包括了哪些方面？

由於瓠瓜栽培面積較小，對其種質資源的創新利用尚處於起步階段。

在瓠瓜種質的創新中，目前主要採用系譜選擇的方法，即選擇遺傳性狀不同的瓠瓜種質資源，通過人工雜交，後代選擇自交純化的方法，獲得優良自交系或品種，創造新的種質。浙江省寧波市農業科學院蔬菜研究所以地方品種「寧波夜開花」為材料，經多代自交選擇，培育出了自交系94-04-3-1，其特點是植株生長勢中等，分枝性強，單株坐果數多，連續結果性好；商品瓜表皮綠色、長棒形，長約50cm，橫徑約4.3cm，瓜頂部尖圓。以寧波地方品種與國外品種雜交後經多代回交、自交選擇育成商品性好、優質的穩定自交系NC94-4-09-15，該自交系表現為熟性早，生長勢強，較耐低溫，抗逆性強。瓜長約50cm，橫徑約4.9cm，瓜皮綠色，瓜頂部鈍圓。浙江省農業科學院蔬菜研究所針對瓠瓜設施栽培中低溫、弱光照等主要限制因子，通過室內外耐冷性鑒定及保護酶活性、葉綠素熒光參數等生理指標測定和篩選，定向選擇培育出了耐低溫、耐弱光的優良自交系，並應用於瓠瓜雜交一代新品種的選育。

廣東省農業科學院蔬菜研究所（2001）在大田裡發現3株瓠瓜雄性不育株，研究表明瓠瓜雄性不育有3種類型：一是花葯退化型，花葯高度退化，大小僅為正常植株花葯的1/3或更小，內無花粉，為完全雄性不育；二是無花粉型，花葯大小接近正常，但無花粉，為完全雄性不育；三是花粉減少型，花葯大小正常，且有花粉，但花粉量少，不到正常植株花粉量的1/2，自交可育，後代出現育性分離。該所正利用上述不育材料進行三系配套研究。

5、什麼是林木種質創新

利用雜交育種、倍性育種、細胞工程、基因工程等技術手段，創造具有新性狀、基因型等林木種質資源的過程。

6、胡蘿卜種質資源創新包括哪些方面？

種質資源創新的途徑較多，如突變體篩選、單倍體培養、種間雜交、原生質體融合、優異基因聚合、轉基因等。這些方面已在胡蘿卜研究中取得了一定的進展。

（一）體細胞無性系突變體篩選

早在20世紀40年代前，人們就已發現植物在細胞或組織培養過程中會產生遺傳退化，形態改變，染色體數及倍性發生變化等。1981年，Larkin和Scowcroft首次提出體細胞無性系變異（Somaclonal variation）這一術語，激起了眾多學者的研究興趣。胡蘿卜是最早作為組織培養研究的模式作物之一，特別是在體胚發生途徑方面取得了重大進展。同時不少學者在此研究過程中也發現了不少突變體，這對特異基因表達、定位及生理研究提供了重要研究材料。

Koyama等人（1990）通過篩選獲得一個胡蘿卜突變系（Insoluble phosphate grower，IPG），可以釋放出大量的檸檬酸到含有磷酸鋁培養基中，而且其生長速度比野生型快。通過深入研究表明突變系中NADP專一異草酸脫氫酶（NADP-specific isocitrate dehydrogenase，NADP- ICDH）的活性比野生型低一半，降低了異檸檬酸向酮戊二酸的轉化，進一步影響了檸檬酸向異檸檬酸的轉化，從而引起胡蘿卜突變系中檸檬酸大量積累。Nothnagell and Straka（2003）獲得了一個黃色葉片的突變株系，通過雜交後代F2和F3的觀察，表明黃色葉片是由單個隱性基因（yel）控制的，並篩選到了10個與其緊密連鎖的AFLP標記。Lo Schiavo（1988）等人在大量胡蘿卜細胞突變體中獲得了一個溫度敏感型的胚胎發生株系ts59，表現在球形胚時期就停止發育，外源IAA也不能激活，在其發育過程中產生大量的熱激蛋白（Heat-shock proteins）。

（二）單倍體培養

自從Guha and Maheshwari（1964，1966）首先獲得曼陀羅單倍體植株（Haploid plant）以來，單倍體研究快速發展，目前已在幾百種植物中獲得了成功。中國在小麥、大白菜、甘藍、辣（甜）椒等作物中取得了很大成功，並培育出了新的優良品種。有關胡蘿卜單倍體培養的研究報道較少。Matsub等（1995）將胡蘿卜未成熟花葯按不同時期（四分期、早期單核期、後期單核期）分別接種到含有不同濃度激素的MS和B5培養基上，三個時期的花葯都獲得了愈傷組織，但只有四分期的花葯獲得了不定胚，比例也很低（1.8%～4.3%）。將游離小孢子接種到NLN和1/2MS培養基上獲得了小愈傷組織，但未能進一步分化。

（三）原生質體非對稱融合

胡蘿卜原生質體非對稱融合研究最早開始於20世紀80年代。Dudits等人（1980）利用X射線輻射歐芹葉片原生質體，和從白化變異的胡蘿卜細胞懸浮系分離的原生質體進行融合，結果獲得了染色體數為2n=19，葉片綠色的非對稱雜種植株。Ichikawa等人（1987）實現了野生種Daucus capillifolius與栽培胡蘿卜的融合，獲得了胞質雜種。對其提取線粒體DNA進行限制性酶切，發現再生植株的線粒體帶型出現了不同於雙親的特異帶。

Dudits等人（1987）利用γ射線輻射處理胡蘿卜懸浮細胞系，與煙草的葉片原生質體進行融合，獲得了遠緣體細胞非對稱雜種。雜種後代具有煙草的形態特徵，同時又具有胡蘿卜的一些抗性。通過對其線粒體DNA和葉綠體DNA的限制性酶切圖譜分析，雜種的葉綠體DNA圖譜與煙草高度一致，而線粒體DNA出現了特異帶，表明胡蘿卜線粒體基因組和煙草的基因組發生了重組（Smith et al.，1989）。

Kisaka等人（1994）通過非對稱融合實現了單子葉植物水稻（Oryza sativa L.）與胡蘿卜間的融合。再生雜種植株具有胡蘿卜的形態特徵，同時又具有水稻5-MT（5-methyltryptophon）的抗性，其染色體數為20～22，遠小於雙親的染色體數之和。通過分析線粒體DNA和葉綠體DNA的限制性酶切圖譜，發現雜種葉綠體基因組與胡蘿卜高度一致，線粒體基因組間發生了重組。通過染色體鑒定和同工酶進一步分析，盡管對胡蘿卜進行輻射處理，但雜種中胡蘿卜的核物質佔多數，水稻的核物質佔少數，出現了受體染色體大量丟失現象。

Tanno-Suenaga等人（1988）利用X射線輻射胡蘿卜褐葯型不育材料28A1的原生質體，與可育材料K5進行融合，成功獲得了新的不育材料。對再生植株的線粒體DNA進行限制性酶切分析，同樣發現了線粒體基因組間的重組現象。隨後，Tanno-Suenaga等人（1991）又用瓣化型不育材料31A的原生質體通過PEG介導與可育材料K5進行融合。一次融合後獲得再生植株均為胞質雜種，不過未表現出瓣化不育特徵，但通過兩步融合法實現了瓣化型不育性在種內的轉移，他們認為這可能與融合雙親的基因型有關。

司家鋼等（2002）利用紫外線輻射處理胡蘿卜瓣化型不育材料7-0-8的原生質體，與可育材料66-3進行電融合，獲得了33株再生植株，通過RAPD標記鑒定，均為胞質雜種。通過對其中4個再生植株進行花期形態學鑒定，全部表現為雄蕊瓣化型。

（四）種間雜交

目前已有許多研究成果表明胡蘿卜種間雜交不存在交配障礙（McCollum，1975；Nothnagel，1992；Nothnagel and Straka，1994），其中橘紅色胡蘿卜可能就是由紫色胡蘿卜與野生種ssp.maximus雜交演變而來的。另外，胡蘿卜商品種子在繁種過程中經常會受到野生種花粉的污染，從而產生一些雜種種子（Small，1984）。使用最多的瓣化型雄性不育系也是來自於胡蘿卜屬Daucus carota L.野生種（McCollum，1966）。

野生胡蘿卜D.carota ssp.gummifer Hook.fil.和栽培胡蘿卜雜交產生了一種異源胞質的橘色胡蘿卜，在這種胡蘿卜中發現了一種新的CMS類型，稱作GUM類型，其特徵是花葯和花瓣的總量減少（Nothnagel，1992）。最近的研究結果表明其遺傳機制是gummifer細胞質和細胞核中的一個隱性基因位點（gugu）相互作用控制這種類型雄性不育性的表達（Linke et al.，1994）。由於其遺傳模式較為簡單，因此這種不育類型可能會成為胡蘿卜育種的一種新的CMS資源（Linke et al.，1994）。

Nothnagel et al.（2000）在此基礎上又進行了多種野生胡蘿卜種或亞種與栽培胡蘿卜間的雜交和回交研究，並獲得了其他兩種具有應用潛力的新型不育資源MAR和GAD。MAR類型來源於D.carrot ssp.maritimus，屬瓣化類型，花瓣白綠色，雄蕊變成「勺子」結構，而其回交後代的雄蕊也呈現出瓣化類型。GAD來自於D.carrot ssp.gadecaei，雄蕊只有花絲結構表達，其他器官發育正常。遺傳研究表明這兩種類型控制雄性不育性表達的核上基因可能不至一個。

Cole（1985）、Ellis等人（1993）對野生胡蘿卜種D.capillifolius的抗性進行評價，認為其對胡蘿卜莖蠅（Psila rosae L.）具有較高抗性，通過6代選擇之後，獲得的株系抗性不如其野生親本高，但比從較抗的Sytan選擇的株系明顯要好。

（五）優異基因聚合

雖然種間雜交、原生質體融合及轉基因等手段可跨越種或屬間的雜交障礙，但是雜交後代為生產所利用往往需要經過漫長的過程。目前許多學者又專注於地方品種資源的有效利用，由於地方品種種類多，存在不同抗性，而且通過對不同種質資源的廣泛雜交、篩選，可獲得新型的種質，並可直接為育種者所利用。

目前生產使用最多的黑田五寸，是由日本學者將日本本地紅色類型與歐洲引進的橘紅色類型雜交篩選獲得的。在20世紀50年代，國外學者就開始進行胡蘿卜種內雜交的研究，並篩選出了大量抗性株系。中國在20世紀80年代開始相關工作，但主要集中在瓣化型雄性不育的轉育，通過多代回交獲得新的雄性不育系和保持系，再進行配組培育一代雜種。但是由於缺乏良好的雜交技術，國內關於胡蘿卜可育系之間的雜交研究一直未開展，因此也難以實現地方資源優異基因的聚合，故有必要深入開展此方面的研究工作。

7、西瓜種質資源有哪些創新？

（一）自然突變

生產和育種過程中，由於自然環境條件下不確定因素的作用，一些西瓜材料常常產生自然的基因突變，表現出特異的性狀，頗有研究和利用價值，成為西瓜種質資源創新的一條很有價值的途徑。比如國內的無杈西瓜、板葉西瓜大葉紅、西瓜G17AB雄性不育兩用系、西瓜子葉失綠致死基因的攜帶株等都是從自然突變中得到的。

（二）雜交創新

兩個或多個具有不同優良性狀的種質進行雜交，對分離後代逐代選育出一個綜合性狀優良的新品種或新種質，這是常規品種選育的主要途徑。比較熟悉的一些常規西瓜品種選育如：

小花狸虎×旭大和——早花

早花×華東24（♀）——龍蜜100×蜜寶——龍蜜104、龍蜜105

早花×紅枚（♀）——中育1號×慶豐——汴梁1號

早花×核桃紋——鄭州2號×興城紅——鄭州3號×中育6號——石紅1、2號

慶豐×蜜寶——中育2號×手巾條——中育9號

手巾條×久比利——中育5號×中育6號——中育10號

20世紀80年代以後，隨著雜交一代西瓜的興起，這種育種方法逐步成為西瓜種質創新的主要途徑。

肖光輝等（1998）報道，用常規雜交轉育的方法將野生西瓜的抗枯萎病性狀轉育到栽培西瓜中，後代在病圃中經7代自交純化和抗性選擇，選育出了4份抗性材料。苗期接種鑒定和疫土自然接種鑒定的結果都表明，選育出的4份材料中，對西瓜枯萎病有2份高抗、2份中抗，對炭疽病的抗性均較強等。

（三）誘變創新

包括化學誘變和物理誘變，主要有以下幾個方面：

1.化學誘變

以秋水仙素誘變西瓜四倍體最為典型，誘變方法不斷改進。譚素英等（1993）採用剝去生長點外幼葉、進行秋水仙液滴芽的方法誘變西瓜四倍體，變異株率可提高到50%～60%。房超等（1996）以幼胚子葉組織為外植體，0.05%的秋水仙液濃度進行西瓜離體誘導四倍體的誘變，變異株率高達50%～60%。馬國斌等（2002）研究認為：採用西瓜莖尖離體誘導四倍體的有利途徑是8d左右苗齡的莖尖，誘變培養基應保持較低的細胞分裂素濃度和0.1%秋水仙素濃度，處理時間為24～48h。

2.60Co γ照射

黃學森等（1995）用60Co γ照射中育1號西瓜種子（劑量376Gy，劑量率0.94～1.98Gy/min），獲得1份輕抗枯萎病和1份無杈的突變材料。

王恆煒等（2003）利用60Co γ射線輻射處理118西瓜干種子，通過7代連續系統選擇、鑒定，選育出了新突變系C68-42-10-9-23-73-82。該突變系表現為中晚熟，植株生長勢強，抗枯萎病，果實圓形，底色淺綠，上覆中寬深綠條帶，果形指數1.01，平均單果重6.4kg，粉紅瓤，中心含糖量10.8%，耐貯運，種子大片，為淡紅色麻籽，千粒重98g。

王鳴、馬克奇等（1988）對原始易位系旭大和及其他幾個優良品系的干種子用60Co γ射線進行重復照射，進一步提高其不育性，並育出一批雜合易位少籽西瓜新品種，其單瓜種子產種量較普通二倍體減少50%～80%，種子數量最少的單瓜中僅含十餘粒至數十粒種子。朝井小太郎、吳進義等（1987、1993）用不同劑量的60Co γ射線輻照二倍體西瓜的干種子、花粉後代，結果各個劑量均可出現染色體易位，並選出易位純合體，培育出華知A雄性敗育系和少籽西瓜易紅1號、5號等。

3.質子束輻射

孫遜等（2002）用不同能量（4、6、8mev）和劑量（25、50、100c）的質子束輻照西瓜干種子的誘變研究發現，質子輻照可誘發有絲分裂行為異常，染色體結構變異——產生微核、染色體橋、染色體斷片等；隨著質子束能量和劑量的提高，染色體畸變細胞率呈增加趨勢；質子束還能引起雌花著生節位的降低、果實提早成熟和瓤質改善。同時，選育出了2份有價值的突變材料。

4.太空搭載育種

方曉中（2002）利用衛星搭載誘變技術處理西瓜干種子，通過太空輻射和微重力雙重作用所產生的遺傳變異，選育新品系、培育新品種。試驗表明，太空處理過的種子在當代種植時基本無變化，F2代以後開始表現不同程度的返祖、染色體加倍、果個變大、品質提高、抗性增強等變異，在搭載的5份材料中，高橋4號變異最明顯，果個比原來增大了20%，並培育出了衛星2號（高橋4號×平5♀）西瓜雜交新品種。另外，崔艷玲等（2004）培育出了航興1～3號幾個西瓜雜交新品種。

1.單倍體培養

中國在西瓜單倍體培養方面很早就有成功報道，比如薛光榮等（1988）分別用瓊酥和周至紅的花葯誘導培育成了植株。誘導的關鍵是選擇小孢子發育在單核靠邊期時的花蕾（花蕾橫徑為5mm左右，花冠明顯突出，花葯增大，質地硬實，易於剝離），去分化培養基上花葯裂口處必須能分化出緻密的愈傷組織。但後來卻未見成功的應用報道。

魏瑛（1999）以MS為基本培養基附加NAA、6-BA和KT，對在4℃和10℃低溫下處理24h和72h的西瓜花葯組織的影響及花葯愈傷組織的形成作了觀察。結果發現處理後的花葯經過前期的褐變，在2個月時開始形成愈傷組織。其中西農8號在4℃低溫下處理72h後的愈傷組織誘導率高達35.01%，NAA在花葯愈傷組織的形成中起主要作用，而不同基因型材料花葯的抗凍性表現出一定差異。

魏躍等（2005）以10個西瓜品種雜交後代F1的花葯作為研究材料，從基因型與激素作用關系等方面對花葯愈傷組織的誘導進行了研究。結果表明：適宜的基因型是花葯誘導培養成功的關鍵因素，不同基因型對激素變化的敏感性不同，最適培養基也不相同。

2.外源DNA的直接導入

根據導入的方法不同可分以下幾種：

（1）花粉管導入 李濤等（1996）應用花粉管通道導入技術將黑籽南瓜DNA導入受體西瓜早花品種，期望得到早熟、抗寒的西瓜新品系，RAPD分析表明，變異後代中產生了與早花西瓜差異明顯、分子量在2kb左右的DNA片段OPY02/2000。

王國萍等（2003）利用西瓜有性生殖過程，通過花粉管通道法直接導入西瓜活體植株的技術，將攜帶有外源幾丁質酶基因的質粒DNA塗抹在授粉後的柱頭上，使其沿花粉管通道進入到生殖細胞，得到轉化處理種子。轉化T1代植株經除草劑Basta篩選和PCR擴增獲得轉化植株。對T3代株系進行田間自然發病和人工接種鑒定獲得3個抗枯萎病的株系。結果表明：幾丁質酶對鐮刀菌引起的西瓜枯萎病有一定的抑製作用。採用的基因為幾丁質酶基因（Chill）來源於水稻，構建在Ti質粒載體pCAMBAR.Chi11上，宿主菌株LBA4404，幾丁質酶基因片段大小為111kb，該質粒上還含有一個Bar（抗除草劑）基因作為轉基因植株的篩選標記基因。

肖光輝等（1999）採用DNA浸胚法將供體瓠瓜的總DNA導入西瓜，D1代獲得一變異株，變異率為0.32%。D2代變異植株成株期功能葉過氧化物酶同工酶酶帶數增加，出現了供體植株的酶帶，變異株部分染色體的臂長、臂比、帶型與受體相比產生了明顯的變異，果實有22.7%的皮色由深綠變成白色或白皮綠網紋，接近供體瓠瓜的皮色，果實形狀有31.0%發生變異：種子的形狀和色澤有33.3%發生變異。初步認為西瓜的性狀變異是供體瓠瓜DNA導入的結果，D3代在病圃中篩選出的D3-1、D3-2、D3-3、D3-4和D3-5材料，性狀已穩定，並且在病圃中表現出對枯萎病的強抗性，苗期接種鑒定結果表明，D3-1和D3-3高抗枯萎病，D3-3和D3-4中抗枯萎病，D3-5輕抗枯萎病。

（2）子房注射法 王浩波等（2001）採用子房注射法將南瓜總DNA導入西瓜，經病圃田間篩選和6代自交純化已獲得5份穩定的西瓜抗病種質材料，對枯萎病的田間抗性得到了顯著提高，有3個株系達到高抗（HR）水平。

（3）基因槍法（微彈轟擊法）任春梅等（2002）以西瓜頂芽為轉化受體，採用基因槍轟擊的方法將質粒pBI121 DNA導入西瓜，旨在建立基因槍介導西瓜遺傳轉化系統。研究表明：預培養時間與轟擊次數對轉化率影響顯著，而擴散腔類型和甘露醇處理質量濃度對轉化率的影響不顯著。經GUS基因表達產物的檢測，Kanr（抗卡那黴素）試管苗的轉化率為33.3%。

3.基因遺傳轉化

隨著基因克隆技術不斷發展，近年來成功克隆的目的基因數目不斷增加，促進了西瓜遺傳轉化的研究。

王春霞等（1997）以2d齡的西瓜無菌苗子葉為外植體，通過與根癌膿桿菌共培，建立了西瓜子葉農桿菌介導法的遺傳轉化系統。所用根癌膿桿菌含有NPT-Ⅱ基因和番茄的ACC合成酶及其反義基因的質粒。Southern-blot分析，NPT-Ⅱ基因已整合到西瓜的基因組，乙烯釋放指標表明，轉入的正義和反義ACC合成酶基因得到不同程度的表達。

王慧中等（2000）研究表明：西瓜子葉外植體能被含雙元載體pBPMWMV的根瘤農桿菌感染，該質粒載體含有一個NPT-Ⅱ基因以供選擇kanr的轉基因西瓜植株以及一個WMV-2 CP基因，kanr西瓜植株經NPT-Ⅱ酶活性檢測、DNA分子點雜交及Southern雜交試驗證明，外源的WMV-2 CP基因已導入西瓜細胞。王慧中等（2003）進一步研究表明：通過自交結合PCR檢測，發現WMV-2 CP基因在轉化植株自交一代的分離符合3：1的分離比。經過連續4代的選擇鑒定，已從T7、T11和T32 3個獨立轉化子的後代中篩選獲得8個轉基因純合株系，性狀表現整齊一致。Western-blot分析結果表明，RT7-1、R4T11-3以及R4T32-7 3個不同來源的株系均能表達產生外殼蛋白。轉基因純合株系WMV-2感染後的病毒抗性實驗表明，與未轉基因對照相比，轉基因株系可以推遲發病時間，減輕發病程度。實驗篩選獲得的轉基因株系R4T32-7也表現出對WMV-2的高度抗性。

陳崇順等（2002）利用西瓜枯萎病尖鐮孢菌的孢子及細胞壁碎片混合液誘導豇豆幼苗特異幾丁質酶的表達，純化了該特異幾丁質酶，測定了其部分氨基酸序列，成功克隆了對西瓜枯萎病菌等病原真菌具高抗作用的特異酶的編碼基因，並與pBI121重組成功構建了幾丁質酶基因植物表達載體，為培育抗枯萎病轉基因西瓜邁出了新的一步。

張自忠等（2005）構建了同時含有番茄幾丁質酶基因（chi3）和B-1、3-葡聚糖酶基因（GLu-AC）的雙價抗真菌基因植物表達載體，以西瓜子葉塊為外植體，採用根癌農桿菌介導法，將chi3和Glu-Ac同時導入西瓜栽培品種中育1號，共獲得46株抗性再生植株。經PCR、Southern-blot和RT-PCR檢測，表明外源基因已成功整合到西瓜基因組中，並在轉錄水平方面得到表達。利用尖孢鐮刀菌西瓜專化型（Fusarium oxysporum）對轉基因植株進行離體葉片抗病性檢測，表明轉基因植株對枯萎病的抗性均有不同程度的增強。

牛勝鳥等（2005）利用西瓜花葉病毒（WMV）外殼蛋白基因、小西葫蘆黃化花葉病毒（ZYMV）復制酶基因、黃瓜花葉病毒（CMV）復制酶基因構建了三價植物表達載體，用根癌農桿菌介導法轉化西瓜子葉外植體獲得了再生植株。經PCR和Southern-blot檢測，證明目的基因成功地導入了西瓜植株，並能夠在後代植株中遺傳，轉化效率約為1.7%。在溫室和大田對T2、T3代轉基因株系進行了病毒接種實驗和抗病性篩選鑒定，轉基因西瓜株系表現出感病、抗病、免疫和症狀恢復等不同的類型。其中BH1-7株系的T3代植株對ZYMV和WMV的抗病能力普遍達到中等水平以上，並保持了受體西瓜品系原有的優良農藝性狀。

8、為什麼要進行甘蔗種質創新？

種質創新是甘蔗育種的基礎，甘蔗品種培育的突破首先在於種質創新的突破。目前，世界甘蔗栽培品種絕大部分僅含有栽培原種中的少數種的血緣（熱帶種、印度種、中國種、野生種的細莖野生種和大莖野生種），資源利用率不足0.1%，遺傳基礎狹窄、親本近親化現象嚴重，近親繁殖後代種性退化。培育突破性品種，解決育成品種生活力、適應性、抗逆性、宿根性差等一系列問題，其根本方法是需要利用更多的新種質進行甘蔗種質創新。

9、我國對蔬菜種質資源進行了哪些創新與利用？

種質資源創新的主要目的是增加種質資源的遺傳多樣性和獲得生產和育種所需的優異種質。按其目標的不同可分為兩大類：一類是以遺傳學工具材料為主要目標的種質資源創新，例如非整倍體材料、近等基因系、雙單倍體系等的創建；另一類是以育種親本材料為主要目標的種質創新（方智遠、李錫香，2004）。近代以來，尤其是達爾文對物種遺傳、變異的解釋和自然選擇、人工選擇的進化理論；孟德爾的後代分離和獨立分配規律；摩爾根的染色體、基因及連鎖遺傳理論創立以及從20世紀70年代興起的分子遺傳學，使種質資源的改良創新以及通過作物遺傳育種改變其性狀方面有了更多的自由（朱軍，2004），也使蔬菜種質資源的改良創新及其遺傳育種取得了較快進步。中國，特別是在「九五」、「十五」期間，「蔬菜種質資源的創新和利用研究」已成為蔬菜種質資源研究的重點，其進步也頗為顯著。

中國從20世紀50年代開始研究甘藍的自交不親和系，並於60年代初由原中國農業科學院江蘇分院、上海市農業科學院園藝研究所，分別在晨光大平頭、黑葉小平頭等甘藍品種中進行自交不親和系的選育，並初步獲得103和105兩份自交不親和系。70年代初，中國農業科學院蔬菜花卉研究所等單位系統地開展了甘藍自交不親和系和雜種優勢利用研究，通過連續自交、分離鑒定、定向選擇的方法，先後選育成7224-5-3等具有不同熟性、不同類型的10個自交不親和系及其配製的「京豐1號」等7個甘藍雜交種，使中國蔬菜雜種一代利用研究取得突破性進展。此外，甘藍顯性核基因不育系的研究也取得了重要進展，它為中國所特有，已在2001年獲得發明專利，並已育成01-216MS等5個具有不同熟性、不同類型的可實用的顯性雄性不育系，為甘藍一代雜種制種開辟了一條新途徑；利用這些不育系作母本，已配製出中甘16、17、18、19、21等5個雜交種，經過審定已開始在生產上推廣應用（方智遠，2002）。大白菜和白菜原產於中國，種質資源十分豐富，經過長期改良，形成了各種不同熟性、不同類型的種類和變種。近20多年來，大白菜已育成一大批具有整齊、抗病、豐產特性的新組合，制種途徑主要採用選育自交不親和系、高代自交系、雄性不育系等。在已育成的200多個組合中，有自交系55個，自交不親合系212個，雄性不育系21個。雄性不育系的選育，已分別育成雄性不育兩用系（單基因雄性不育）、核基因互作雄性不育系、甘藍型油菜雄性不育系等，這些不育系進一步豐富了親本的種質資源類型（徐家炳、張風蘭，2002）。在白菜的親本改良上，南京農業大學，上海、廣東等省（市）農業科學院主要在當地的優良地方品種中，選育出一批自交系或雄性不育兩用系，已配製出一代雜種矮雜系列、矮抗系列、黑葉白菜17號、夏冬青等品種，並廣泛在生產上應用。中國辣椒種質資源豐富，類型多樣，很有利於種質資源的改良創新。張繼仁（1980）從湖南地方品種中篩選出衡陽伏地尖辣椒等7個優良地方品種及道縣早泡椒等10個在某一或若干個性狀上比較突出的品種。江蘇農業科學院蔬菜研究所從地方品種中篩選出如南京黑殼等優良地方品種，進而選育出一批新的親本材料。中國農業科學院蔬菜花卉研究所引用對TMV和CMV抗性較強的辣椒品種二斧頭、燈籠椒、欒川椒與易感病但經濟性狀好的茄門、同豐37號甜椒作親本，通過雜交分離、多代回交、抗病性鑒定等方法，篩選出90-109、90-111、90-138、91-126、90-136等系列優良親本。其他如北京、沈陽、天津市等地有關研究單位也各選育出一批優良親本材料。進而形成了中椒、湘研、蘇椒、甜雜、沈椒、遼椒、哈椒、津椒、海花等在國內生產上頗具影響力的系列優良品種。與辣椒相似，中國黃瓜種質資源也相當豐富，一大批各種類型的地方良種經過育種工作者的改良創新已成為生產上廣泛應用的雜交種的重要親本材料。如天津黃瓜研究所以抗性較好的地方品種天津棒槌瓜和唐山秋瓜為材料，雜交選育出津研系統黃瓜。又如華北刺瓜類型的北京大刺、長春密刺、新泰密刺、寧陽大刺等地方品種及華南類型的安徽小白條、成都二早子、廣州青皮吊瓜、廣州大青黃瓜等等，對育成現有各種系列的雜交種提供了豐富的種質資源（侯鋒，1999）。目前如天津黃瓜所的津綠、津春、津優系列，中國農業科學院蔬菜花卉研究所的中農系列，北京市農林科學院蔬菜研究中心的北京系列和迷你系列，廣東省農業科學院的粵秀黃瓜等等均包含了華北、華南類型以及國外溫室黃瓜的親緣關系。

應用國外種質材料經過改良並用於中國蔬菜新品種選育的例子很多，在番茄和辣（甜）椒的新品種選育上更為突出，20世紀70年代由日本引進的番茄品種強力米壽除在生產上直接大面積推廣應用外，還被選育成自交系，在中國農業科學院蔬菜花卉研究所育成的中蔬系列番茄品種中作為親本材料利用。70年代由美國引進的番茄種質材料瑪納佩爾Tm-2v是番茄抗煙草花葉病毒（TMV）的抗源，含抗病基因Tm-2v，該品種表現特別，具有苗期生長緩慢、葉片黃化、開花遲、結果少、果實小等特點。經中國農業科學院蔬菜花卉研究所、江蘇、西安、北京等蔬菜科研單位根據育種目標進行轉育，已先後選育成如粉果、有限生長、大果等不同類型含抗病基因Tm-2v的材料，並以此為親本育成了中蔬、中雜、紅雜、蘇抗、佳粉、佳紅、西粉、浦紅、浙紅、浙粉、東農、渝雜等系列品種。據不完全統計，以上單位所培育出的含Tm-2v基因的一代雜種，每年制種量約逾10萬kg，佔全國番茄商品用種量的50%左右，累計推廣面積約66.7萬km，且大大降低了煙草花葉病毒（TMV）在全國的危害程度，改善了市場供應，社會經濟效益顯著。又如由美國引進的組合力強的Ohio-MR9、含抗葉霉病的系列基因，經過改良轉育成抗病材料，並育成了一大批露地和保護地番茄良種。此外，由日本引進的，用英國溫室作物研究所篩選出的6個不同基因番茄品種組成的GCR系統番茄，作為番茄上TMV株系的鑒別寄主譜，對摸清中國番茄煙草花葉病毒（TMV）危害情況具重要作用（李樹德、馮蘭香，1995）。在辣（甜）椒國外優良種質資源的引進上，如中國農業科學院蔬菜花卉研究所從法國引進的優良抗病材料，有抗白粉病的H3、CI、PRIMOR等材料，以及2個抗疫病的商業品種，通過系譜選擇法選出了6個優於茄門、對疫病達到抗病和高抗水平的株系，其中4株系兼中抗黃瓜花葉病毒（CMV）和煙草花葉病毒（TMV），對進一步開展甜椒抗疫病育種具有積極作用（張寶璽等，2005）。中國農業科學院蔬菜花卉研究所創新的黃瓜新種質「G5224」，結合了北京小刺、歐洲品種和美國品種的優點，表現全雌性、極早熟、耐低溫、高抗角斑病、枯萎病，抗黑星病、白粉病和霜霉病，實現了具有不同血緣的抗病基因源的聚合。新種質「1613」源於歐洲型溫室黃瓜與華北型刺瓜雜交選系，該材料表現強雌性、極早熟、耐低溫、高抗角斑病、枯萎病，抗黑星病、白粉病和霜霉病。另外，利用具有野生血緣的優良加工抗病品系S452和優良炸片加工品種Atlantic的優點創造出馬鈴薯新種質「中蔬9408-1」，其炸片顏色為2.5級（美國快餐食品協會標准1～10級，以1級為最優），相對密度（比重）為1.092，平均干物質含量為22.19%，產量比對照品種大西洋增產13.65%。室內接種鑒定，抗馬鈴薯X病毒，高抗馬鈴薯Y病毒；田間鑒定抗馬鈴薯晚疫病。這將在改變國內馬鈴薯市場加工品種為國外品種所獨占的局面中發揮重要作用。上述研究結果表明，通過常規雜交、分離、回交、選擇等方法進行蔬菜種質資源的改良創新仍是目前採用的主要方法，而且效果顯著。

除採用上述方法外，近年還利用花葯和游離小孢子培養技術，選育優良的親本材料。花葯和花粉培養是快速獲得優良純系的有效方法，與常規多代自交獲得純系相比，具有周期短、效率高、純系穩定等特點。而游離小孢子培養還具有花葯培養所不具備的單細胞單倍體、群體數量多、自然分散性好、不受體細胞干擾、便於遺傳操作等優點，而且能夠快速獲得雙單倍體高純度材料。河南省生物技術研究所在近10多年的時間里採用該項技術成功地培育、繁殖了大白菜品種8個，推廣面積20萬km。這是小孢子培養技術在蔬菜種質資源創新和遺傳育種上的成功例子。此外，在芸薹屬植物中先後對油菜、芥菜、大白菜的、白菜、甘藍和蕪菁等進行了游離小孢子培養，並獲得了再生植株（蔣武生等，2002）。北京市海淀區植物組織培養技術實驗室利用從日本引進的平安榮光品種，經花葯培養和選育，1982年育成了中國首個花培甜椒品種海花3號；利用保加利亞辣椒經花培育成了海花1號辣椒，並進一步育成用花培品系作親本的海豐系列雜交種10餘個，在生產上大面積推廣。此外，張家口市蔬菜研究所經多年研究也育成了以塞花命名的花培品種，並在生產上推廣應用（鄒學校、蔣鍾仁，2002）。游離小孢子培養和花葯培養技術，在細胞水平上為蔬菜種質資源的改良、創新和遺傳育種開拓了一條新的途徑。

近年，原生質體培養和體細胞雜交技術也已用於蔬菜種質資源的改良與創新研究。胡蘿卜原生質體融合在7個融合組合中獲得再生植株，在1個融合組合中成功地實現了胡蘿卜瓣花性雄性不育性的轉育。原生質體融合獲得6個優良茄子品種與兩個茄子野生遠緣種的體細胞雜種植株，並將野生茄子中的抗病基因轉到普通茄子中（李錫香等，2006）。

此外，植物基因工程在蔬菜種質的改良與創新方面也取得了一些新進展，例如在控制蔬菜果實成熟基因的利用上取得了成功。葉志彪等利用番茄乙烯形成酶（EFE）cDNA克隆，構建反義載體，通過農桿菌Ti質粒介導，轉化子葉外植體，感染的外植體與農桿菌共培養，再生出完整的番茄植株。經檢測，導入的標記基因能在後代中遺傳傳遞。所獲得兩個轉基因株系的EFE活性和乙烯的生成均受到明顯的抑制，不及對照的10%。貯藏試驗表明，轉基因植株果實的好果率在貯藏88～92d後仍在80%以上，比對照貯藏期延長8～10倍，而其他特性與原親本相似（葉志彪等，1995）。

10、怎樣進行甘蔗種質創新？

甘蔗種質創新主要通過有性雜交或基因工程技術向甘蔗導入野生種質或外源基因來達到創制新種質的目的。種質創新包括材料創新和方法創新兩個方面。甘蔗種質雜交創新主要包括：①高產、高糖的高貴種受體親本同抗逆性強的野生種之間的基礎性雜交，產生具有優良特異材料或育種中間材料；②通過適當的遺傳交配設計，從優良中間材料的高度變異的F群體中，應用配合力和遺傳力分析，評價出具有商業利用價值的商品性雜交，從而產生優良親本材料或育種中間材料；③利用基因工程技術把外源目的基因應用基因槍或農桿菌兩種渠道轉化某些甘蔗良種，使之表達外源目的基因特性的轉基因甘蔗。